黄达明，张 雪，管国强，宋庆春，李 倩

(江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013)

发酵豆粕是指利用有益微生物发酵豆粕，同时产生微生物蛋白质，丰富并平衡豆粕中的蛋白质营养水平，最终改善豆粕的营养品质，提高饲料品质［1］。发酵豆粕已成为豆粕开发生产的热点。朱平军［2］等对黑曲霉发酵豆粕酸溶蛋白含量的影响条件进行了优化，优化后酸溶性蛋白含量为13.62%。Teng Da［3］等对米曲霉和枯草芽孢杆菌对豆粕的生物改性进行了研究。

多菌种联合发酵豆粕是利用微生物之间互补的关系，把几种微生物有机结合在一起，能产生优于单菌发酵的效果［4］。响应面法是数学方法和统计方法结合的工程优化方法，主要用于对生物产量受多个因素影响的问题进行建模和分析，其最终目的是优化该响应值，从而快速有效地确定最佳条件。近年来，响应面法在化工、生物、食品等领域也都得到了广泛应用［5］。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豆粕，马铃薯 均为市购;米曲霉，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母 保存于本实验室;硫酸铜、硫酸钾、硫酸、硼酸、三氯乙酸、氢氧化钠 均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

YC－L型冷冻恒温振荡器 镇江格瑞生物工程有限公司;FA1004系列电子天平 上海上平仪器有限公司;YM50Z压力蒸汽灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司;80－2型离心沉淀机 江苏金坛市中大仪器厂;UDK149型全自动凯氏定氮仪 意大利VELP公司;SHP－100型智能生化培养箱 上海三法科学仪器有限公司;DHG－9240A型电热恒温鼓风干燥箱 上海三法科学仪器有限公司。

1.2 培养基

米曲霉保存采用PDA培养基。

枯草芽孢杆菌保存及液体种子培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基。

酿酒酵母保存及液体种子培养基采用YPD培养基。

基础发酵培养基:取豆粕20g，按料水比2∶1加入一定量的水，121℃灭菌30min，取出后晃动使其不贴壁。

1.3 实验方法

1.3.1 种子液的制备 将米曲霉接入斜面，28℃培养72h，斜面长满孢子后加入无菌水将孢子洗下，制成孢子悬液(109个/mL)。从枯草芽孢杆菌和酿酒酵母斜面分别挑取两环菌种到液体培养基，摇床培养24h达到生长对数期，做种子液备用［6］。

其工作原理是：通过旋转盘根压盖来挤压铜压套，铜压套压紧盘根，盘根在密封函内弹簧的作用下被纵向挤压发生横向膨胀，从而密封柱塞与密封函的环形空间，防止高压水刺漏及空气进入工作腔。

1.3.2 对峙试验 在PDA培养基上进行对峙培养，观察米曲霉，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母在相同培养条件下是否能较好的共存，以便应用于发酵豆粕［7］。

1.3.3 酸溶性蛋白含量的测定 根据GB/T22492－2008大豆肽粉中的方法提取发酵豆粕中的酸溶性蛋白［8］:准确称取样品1g于100mL烧杯中，加入15%三氯乙酸溶液50mL，混合均匀，静置5min;以中速定性滤纸过滤，弃去少许初始滤液，将滤液转移至离心管，4000r/min下离心10min。取离心后的上清液用凯氏定氮仪测定酸溶性蛋白的含量。

1.3.4 单因素试验 发酵培养基初始含水量为50%，接种量为10%，接种比例1∶1∶1，培养温度为28℃，以酸溶性蛋白含量为指标，分别研究接种顺序(同时接种，24h接入或者48h接入具体见表2)、枯草芽孢杆菌∶酿酒酵母∶米曲霉接种比例(2∶2∶1，2∶1∶1，1∶1∶1，1∶2∶1，1∶1∶2，1∶2∶2)、接种量(8%，10%，12% ，14%，16%)、含水量(40%，50%，60%，70%，80%)、发酵温度(26，28，30，32，34℃)和发酵时间(48，60，72，84，96h)六个因素对豆粕发酵的影响效果。

1.3.5 响应面设计 根据单因素试验所筛选的最佳接种量，含水量和发酵温度，应用三因素三水平的Box－Behnken 设计［9］，以酸溶性蛋白含量为响应值，采用响应面法进行分析，试验因素及水平见表1。响应面试验结果运用Design Expert7.0.0分析软件进行方差分析。为了验证所得结果的可靠性，结合实际试验条件，在优化条件下进行验证试验，经过3次平行试验，取平均值。

表1 Box－Behnken试验因素水平及编码Table 1 Factors and levels of Box－Behnken experiments

2 结果与分析

2.1 对峙试验

微生物本身代谢会产生不同种类的细菌素，在不同微生物或同一微生物的不同菌株之间可能产生相互拮抗相互兼容或相互促进生长的作用［7］。这些物质构成复杂，作用机理尚不清楚，但通过混合培养试验能清晰地显示不同菌株之间的作用。本试验通过米曲霉，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的对峙生长试验，结果显示枯草芽孢杆菌，米曲霉和酿酒酵母能共同生长，相互之间不存在拮抗性。

图1 菌株的对峙试验Fig.1 Confrontation test of strains

2.2 单因素试验

2.2.1 接种顺序的确定 由表2可以看出，不同的接种顺序对酸溶性蛋白的含量有很大的影响。试验1是三株菌同时接种，酸溶性蛋白的含量只有10.03%;若先接种枯草芽孢杆菌24h后再接种酿酒酵母和米曲霉，酸溶性蛋白含量最高可达19%。因此最佳接种顺序为先接种枯草芽孢杆菌，24h后接种酿酒酵母和米曲霉。

表2 不同接种顺序对酸溶性蛋白含量的影响Table 2 Influence of different inoculation order on the acid soluble protein content

2.2.2 发酵时间的确定 发酵时间的长短直接影响发酵豆粕的品质［10］。发酵时间对发酵豆粕酸溶性蛋白含量的影响如图2所示。随着发酵时间的延长，发酵豆粕中酸溶性蛋白的含量不断增加，在72h时达到最高，之后出现下降平稳趋势。考虑到工业化生产易染菌，严格控制发酵周期，保证发酵豆粕品质，选择72h为最佳。

图2 发酵时间对酸溶性蛋白的影响Fig.2 Influence of fermentation time on the acid soluble protein

2.2.3 接种比例和接种量的确定 不同的接种比例和接种量交互影响发酵豆粕中酸溶性蛋白的含量，选取枯草芽孢杆菌∶酿酒酵母∶米曲霉接种比例(2∶2∶1，2∶1∶1，1∶1∶1，1∶2∶1，1∶1∶2，1∶2∶2)分 别 对 应 试验编号1～6，由图3中的a图可以看出，当接种比例为1∶1∶2时，发酵豆粕的酸溶性蛋白含量最高为18.34%。米曲霉含量低的接种比例对应酸溶性蛋白含量稍低，因此选择最佳接种比例为1∶1∶2。

图3中的b图显示当接种量为8%时，酸溶性蛋白含量较低，随着接种量的增加酸溶性蛋白的含量先增加后降低。在接种量为10%时，酸溶性蛋白的含量达到最高18.09%，因此，选择10%为最佳接种量。

图3 不同接种比例及接种量对酸溶蛋白含量的影响Fig.3 Influence of different proportion and inoculated quantity on the acid soluble protein content

2.2.4 发酵温度的确定 由图4看出，豆粕发酵过程中酸溶性蛋白的含量有先增加后减少，最后达到平缓的趋势。由于枯草芽孢杆菌的最适温度是37℃，而酿酒酵母和米曲霉的最适温度在28℃左右，不在同一范围，混菌发酵温度不一定是某一种菌的最适生长温度，因此由图4知，混菌发酵的最佳温度在30℃左右。

图4 发酵温度对酸溶性蛋白含量的影响Fig.4 Influence of fermentation temperature on the acid soluble protein content

2.2.5 含水量的确定 对于固态发酵来说，培养菌基质中的水分含量是影响菌体酸溶蛋白增加的一个重要因素［11］。本试验发现含水量从40%到80%过程中，发酵豆粕中酸溶性蛋白的含量先增加，后平稳，之后下降又有上升趋势。如图5，当含水量为60%时，酸溶性蛋白的含量最高。

图5 含水量对酸溶性蛋白含量的影响Fig.5 Influence of water content on the acid soluble protein content

2.3 响应面分析

2.3.1 响应面设计及结果 综合分析单因素试验，确定接种顺序、发酵时间和接种比例3个因素，选择对酸溶性蛋白含量影响显著的接种量、含水量和发酵温度3个因素为自变量，根据Box－Behnken的设计原理，以酸溶性蛋白含量为响应值设计试验。响应面试验设计及结果见表3。

2.3.2 回归模型的建立及方差分析 使用Design Expert7.0.0分析软件，对试验数据进行拟合，得到二次多项回归方程:

由表4回归模型方差分析可知，二次回归模型极显著，失拟项不显著，说明建模成功。响应面的回归系数R2=0.9574，校正后的 Adj R2=0.9027，Adeq Precision测得的信噪比=11.689通常大于4，这表明该模型的拟合程度较好，实验误差较小，能够用于发酵豆粕条件的分析和预测［12］。方差分析结果还表明，B和C对酸溶性蛋白含量的影响显著，A2和B2对酸溶性蛋白含量的影响极显著，说明B含水量是影响豆粕发酵过程的重要因素，而AC的交互作用影响极显著。从方差分析表中的F值可知，各因素对发酵豆粕酸溶性蛋白含量的影响程度大小为:含水量＞发酵温度＞接种量。

表3 Box－Behnken设计及结果Table 3 Design and results of Box－Behnken

表4 回归模型的方差分析Table 4 Analysis results of regression and variance

2.3.3 响应面分析 从图6可以看出，在所选的范围内存在极值点。响应值酸溶性蛋白的含量随着接种量、含水量、温度呈现先增大后下降的趋势，且三个响应曲面都呈开口向下的凸形曲面。根据响应面法建立的数学模型分析，预测出最佳发酵条件为:接种量10.17%、含水量60.23%、温度32℃，响应面模型在此条件下预测到的酸溶性蛋白含量为21.07%。

2.3.4 验证试验 考虑到试验的实际情况和操作可行性，对最佳发酵条件进行调整，最佳发酵条件选取接种量10%、含水量60%、发酵温度32℃，3次平行试验的结果表明，发酵豆粕酸溶性蛋白的含量为20.73%，与预测值相近，说明模型准确性较高，能较好地预测豆粕的发酵条件。

图6 接种量和含水量、接种量和温度、含水量和温度对酸溶性蛋白含量影响的响应面图Fig.6 Response surface of inoculation quantity and water content，inoculation quantity and temperature，water content and temperature on the influence of acid soluble protein content

3 结论

对峙试验表明米曲霉、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母相互兼容，能用于混菌发酵豆粕。单因素试验研究了接种顺序、接种比例、接种量、含水量、发酵时间和发酵温度对酸溶性蛋白含量影响的趋势，在此基础上运用响应面分析得出最佳发酵工艺条件:接种量10%、含水量60%、发酵温度32℃、发酵时间72h、接种比例为1∶1∶2和接种顺序为先接枯草芽孢杆菌24h后接种酿酒酵母和米曲霉。在最佳条件下，发酵豆粕酸溶性蛋白的含量为20.73%。

研究表明，枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和米曲霉混菌发酵豆粕，能很好的降解大分子蛋白，提高酸溶性蛋白的含量，提高豆粕的利用率。

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