杨 锐 王芬珍

在体大鼠心肌缺血再灌注损伤中NF-κBp65与AngⅡ表达的变化

杨 锐 王芬珍

目的观察在体大鼠心肌缺血的不同再灌注时程NF-κBp65与AngⅡ表达的变化。方法40只大鼠采用随机数字表法分为R15min组、R30min组、R60min组、R120min组及对照组。经缺血30min及不同时间的再灌注（15，30，60，120 min）而建立在体心肌缺血再灌注损伤模型。以ELISA法定量检测NF-κBp65蛋白的DNA结合活性；采用放射免疫分析法检测血浆及心肌组织AngⅡ含量。通过Pearson相关性检验对NF-κBp65与循环及心肌局部的AngⅡ含量做相关性分析。结果NF-κBp65蛋白表达量随再灌注时间的延长呈升高趋势，于R60min时达高峰，R120min组与R60min组比有所下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05），但仍高于R30min组；各实验组血浆及心肌局部AngⅡ含量与对照组比明显升高，随再灌注时间的延长呈升高趋势，差异有统计学意义（P＜0.05），两者呈直线正相关（r=0.859、0.809，均P＜0.05）。结论心肌缺血再灌注损伤时NF-κBp65及血液与心肌AngⅡ均增高。

缺血再灌注损伤；核因子-κB；血管紧张素Ⅱ

20世纪80年代以来，随着心脏介入治疗学的推广应用，心肌缺血再灌注损伤（IRI）的现象日益引起学者们的关注。核因子-κB（NF-κB）是一类与多种基因的启动子或增强子上的κB位点发生特异性结合并促进基因转录的蛋白质总称，其为一个氧化还原敏感的可诱导的转录因子，参与机体的免疫应答、炎症反应及细胞的生长调控,在机体多种生物活性物质合成的转录调控中发挥重要作用。近年的研究表明，NF-κB亦参与心肌缺血再灌注所致的心肌炎性反应、凋亡、坏死、心功能下降等病程的发生发展[1]。因此，NF-κB与心肌IRI的关系备受关注。肾素-血管紧张素系统（RAS），尤其是心脏RAS的发现，是近10余年来RAS研究的重大进展，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）作为RAS的主要活性肽，参与心肌IRI发生发展。为此，本研究观察在体大鼠心肌缺血再灌注不同时程NF-κBp65蛋白与AngⅡ表达的变化，初步探讨它们在此病理生理过程中的作用及机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器（1）NO.78833核蛋白提取试剂盒由德国Pierce公司提供；ELISA试剂盒（Catalog Nos 40096）由美国Active Motif公司提供；标准蛋白（Catalog Nos 31102）由美国Active Motif公司提供；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；AngⅡ放射免疫分析药盒由北京北方生物技术研究所提供；兔抗NF-κBp65多克隆抗体[SC-109（A）]由美国Santa Cruz公司提供；羊抗兔MaxVisionTM二抗试剂盒（一步法）由福州迈新生物技术开发有限公司提供；DAB显色试剂盒由北京中山生物技术开发有限公司提供。（2）SN-682B-3型放射免疫γ-计数器由中国安徽中科公司提供；小动物呼吸机（TKR-200C）由江西特力麻醉呼吸设备公司提供；CX21光学显微镜BX-41显微数码成像系统由日本OLYMPUS公司提供；UV-2501PC紫外分光光度计由日本岛津公司提供；5810R高速低温离心机由德国Eppendorf Centrifuge公司提供。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组和模型的制作雄性健康清洁型SD大鼠40只，体重250～300g，由福建医科大学动物中心提供。采用随机数字表法分为5组：（1）缺血30min再灌注15min（R15min组）；（2）缺血30min再灌注30min（R30min组）；（3）缺血30 min再灌注60 min（R60min组）；（4）缺血30min再灌注120min（R120min组）；（5）对照组。参照文献[2]改进建立动物模型：大鼠经10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉仰卧位固定，颈部去毛，作正中纵向切口约1cm长，钝性分离皮下喉部肌肉，暴露气管，插入大小适宜的气管套管。剪去胸前手术区毛，左胸（正中线旁约0.5cm）作2cm长的纵向切口，钝性分离胸大肌，暴露肋骨，呼吸机与气管插管连接，设置潮气量1.5ml/100g，频率60次/min。分离第四肋间肌，剪开心包，充分暴露心脏（主要是心底部），使左心耳与肺动脉圆锥之间的心大静脉清晰可见（左冠状动脉主干在此与之并行），以此静脉为标志，在左心耳下方2mm处用6/0 Prolene线穿过，进针深度为1～1.5mm，宽2～3mm，横跨心大静脉备用。实验组将丝线两端穿入一管径2mm的聚乙烯管，推管压迫心肌使冠状动脉左前降支造成左心室前壁心肌缺血30min，然后松开线，分别再灌注15min、30min、60min、120min，对照组仅穿线但不收紧线。实验开始同时将针形电极插入四肢皮下监测Ⅱ心电图，ST段抬高0.2mV标志心肌缺血，以ST段骤降1/2以上标志再灌注成功。其中实验过程中出现心室颤动、出血过多及未到观察总时间死亡者弃之不用，直至达到实验目标数。

1.2.2 标本的采集与处理于实验结束相应时间点取材。（1）取血：迅速开腹，下腔静脉穿刺取血2ml，加入含蛋白酶抑制剂的真空试管用于血浆AngⅡ含量的检测。（2）取组织：迅速剪取平行房室沟下2mm处的心室肌，取左心室游离壁为缺血区心肌，分成2小块，一块迅速置入冻存管，液氮中速冻后转移至-80℃冰箱保存，用于核蛋白的提取；另一块新鲜组织用于检测组织AngⅡ含量。按试剂盒说明书处理样本,采用均相竞争放射免疫分析法直接测定血浆和心肌中的AngⅡ含量。

1.2.3 心肌组织NF-κBp65蛋白核易位及转录活性的检测用NF-κBp65蛋白的特异性抗体对心肌组织进行免疫组织化学检测，以PBS代替第一抗体做阴性对照组；进一步提取大鼠心肌组织细胞核蛋白，按照考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒说明书，定量细胞核蛋白数量，按TransAM NF-κBp65蛋白活性检测试剂盒说明书，采用ELISA法检测。

1.3 观察指标血浆及心肌组织AngⅡ含量的变化；心肌组织NF-κBp65蛋白核易位变化及蛋白转录活性。

1.4 统计学处理采用SPSS 13.0统计软件。计量资料以表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，两两之间比较采用LSD-t检验。相关性分析采用Pearson直线相关分析法。

2 结果

2.1 各组光镜下组织形态变化各实验组大鼠随再灌注时间的延长进行性出现心肌纤维大片状坏死，界线不清，胞浆淡染，核浓缩或核溶解，部分心肌纤维扭曲、肿胀、断裂，伴有大量中性粒细胞及淋巴细胞浸润（图1A～D）；而对照组大鼠左心室心肌纤维排列呈束状，结构清楚，心肌间质未见炎性细胞浸润，未见明显组织学改变（图1E）。

2.2 各组NF-κBp65蛋白核易位变化及蛋白转录活性比较见表1、图2。

由表1、图2可见，IRI诱发后15min即可见胞浆表达增强，同时活化的NF-κBp65蛋白发生核易位，且其表达量呈现一定的时间依赖性，于R60min时达高峰，R120min时又有所降低，但仍高于R30min组，各组之间差异均有统计学意义（均P＜0.05），阴性对照组未见阳性表达，对照组在心肌细胞胞浆中少量表达，偶见核易位；进一步检测NF-κBp65蛋白活性发现IRI后NF-κBp65蛋白被迅速激活，与对照组比较，各实验组NF-κBp65蛋白活性显著升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。IRI后NF-κBp65蛋白于R60min时达高峰，而后活性有所降低，但R120min时仍高于R30min，各IRI组之间差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.3 各组血浆及心肌组织AngⅡ含量比较见表2。

图1 各组心肌组织HE染色（×400）。A.R15min组；B.R30min组；C.R60min组；D.R120min组；E.对照组。

表1 各组NF-κBp65蛋白核易位变化及蛋白转录活性比较

图2 免疫组织化学染色法测定各组NF-κBp65核易位变化（×400）。A.R15min组；B.R30min组；C.R60min组；D.R120min组；E.阴性对照组；F.对照组。

表2 各组血浆及组织AngⅡ含量比较

由表2可见，各实验组血浆AngⅡ含量与对照组比较均升高（P＜0.05），且随再灌注时间的延长呈增高趋势，但R15min组与R30min组、R60min组与R120min组比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。与对照组比较，各实验组组织AngⅡ含量明显升高（均P＜0.05），组织AngⅡ含量随再灌注时间的延长呈升高趋势，R15min组与R30min组差异无统计学意义（P＞0.05），余各组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.4 NF-κBp65活性与AngⅡ表达的相关性分析见图3、4。

由图3、4可见，随着NF-κBp65活性的增强，血浆及心肌组织AngⅡ含量呈上升趋势，NF-κBp65活性与血浆及组织AngⅡ含量均呈直线正相关（r=0.859、0.809，均P＜0.05）。

图3 NF-κBp65活性与血浆AngⅡ含量关系

图4 NF-κBp65活性与组织AngⅡ含量关系

3 讨论

急性缺血性心脏病的基础性治疗是早期再灌注以恢复心肌代谢平衡，但事实上缺血期处于可逆损伤的心肌细胞经恢复血液供应后可能转化为不可逆损伤，称为心肌IRI[3]。这种损伤是由多种触发物、媒介物效应器参与的复杂生物反应过程，涉及多种复杂细胞信号转导机制，并在多层次和诸多环节存在交互作用[4]。其中NF-κB、RAS等信号系统在IRI中发挥着关键性作用[5]。

NF-κB是一个氧化还原敏感的可诱导的前炎性转录因子，几乎存在于所有的哺乳动物细胞，由多亚单位组成，其中最常见的激活形式是p50或p52/ p65异源二聚体。现已明确，NF-κB参与机体的免疫应答、炎症反应及细胞的生长调控，在机体多种生物活性物质合成的转录调控中发挥重要作用。缺血再灌注激活NF-κB，在转录水平NF-κB调控的物质均能直接或间接地参与心肌IRI，从而对心肌功能产生很大的负性效应，而这些因子反过来又能激活NF-κB，从而形成正反馈，进一步扩大局部炎症反应[6]，同时NF-κB还通过与其它转录因子的协同作用，在转录水平上形成复杂的基因调控网络[7]。本研究通过ELISA法对NF-κBp65蛋白发生核转录后的DNA结合活性准确定量，结果显示心肌IRI后NF-κBp65蛋白被迅速激活，与对照组比较各实验组NF-κB p65蛋白的DNA结合活性显著升高，于R60min时达高峰，R120min时又有所下降，但仍高于R30min时，可能归咎于抑制型-κB（IκB）的降解和（或）NF-κB激活的促炎因子的反向激活，NF-κB参与基因转录后，细胞内IκBα的合成随之启动，新合成的IκB使与DNA结合的NF-κB二聚体失活，NF-κB返回到细胞质重新利用[8]。可以看出NF-κBp65激活与心肌IRI密切相关，在此病理过程中，NF-κB激活是炎性介质级联反应的“扳机事件”，因此研究其表达变化规律可能会找到防治心肌IRI合适的调节点。

组织RAS，尤其是心脏RAS的发现,是近10余年来RAS研究的重大进展[9]。心脏的RAS独立而完整,它包括肾素（RE）、血管紧张素转化酶（ACE）、AngⅠ、AngⅡ及其受体（AT1R和AT2R）等，其中AngⅡ是主要活性成份。心脏局部的RAS通过自分泌、旁分泌及细胞内分泌等方式对心肌细胞起调节作用，以保证正常的功能状态，其功能有收缩冠状动脉、增加心肌收缩力、刺激心肌细胞生长及缺血再灌注过程中影响心肌代谢和电活动稳定性等。但同时它在急性心肌缺血的发生发展及病情演变中扮演着重要的角色。近年研究发现，心肌IRI时心肌组织RAS被激活,使局部的RE、AngⅠ、AngⅡ含量均增加，AngⅡ对缺血心肌具有众多的不利影响[10]，如：能量耗竭；细胞内Ca2+超载；损伤内皮功能等，并与病情的严重程度呈正相关[11]，AngⅡ还有致炎作用[12]。我们观察血浆及心肌组织AngⅡ含量的改变，结果发现与对照组比较各实验组血浆AngⅡ含量明显升高，随再灌注时间的延长有升高趋势，后期变化不明显，提示IRI早期可迅速诱导循环RAS激活，以提供短期支持效果；而缺血区心肌AngⅡ含量随再灌注时间的延长呈升高趋势，变化显著，提示心肌局部RAS在IRI早期即被激活并随再灌注时间的延长持续发挥作用。因此，我们认为在心肌IRI的病理过程中，循环及局部RAS均被迅速激活，而且可能是心肌局部的RAS发挥更强大而持久的作用。

通过相关性分析发现NF-κBp65与血浆及心肌组织的AngⅡ含量均具有显著的直线正相关，已有多项研究显示两者IRI中相互调节、相互促进、相互影响，利用其表达变化规律可能找到合适的防治心肌IRI调节点后续，我们将在后续的研究中进一步探讨。

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The changes of NF-κB p65 and Angll during myocardial ischemia-reperfusion injury in rats

YANG Rui，WANG Fenzhen.
Department of Cardiology，the Ningbo NO.1 Hospital.Ningbo 315000,China
Corresponing author:YANG Rui，E-mail：youngrui@hotmail.com

ObjectiveTo observe the changes of NF-κB p65 and AngⅡduring various periods of myocardial ischemia-reperfusion.Methods40 rats were randomly divided into R15min,R30min,R60minand R120mingroups and control group.Rat model of myocardial ischemia-reperfusion was established based on 30-min ischemia followed by reperfusion for various periods(15,30,60,120min).The DNA-binding activity of NF-κB p65 was detected quantitatively by ELISA. AngⅡin blood plasma and myocardium were measured by radioimmunoassay.The relevance of NF-κB p65 to AngⅡin blood plasma and myocardium was analyzed by Pearson correlation test.ResultsThe expression of NF-κB p65 had a tendency toward increase in parallel to the prolongation of reperfusion,with the highest in group R60min,followed by group R120minand group R30min.There was significantly different between any two groups(P＜0.05).AngⅡin blood plasma and myocardium was significantly higher in each ischemia-reperfusion group than in control group,which gradually increased with the prolongation of reperfusion(P＜0.05).There was a positive linear correlation between NF-κB p65 and Ang II in blood plasma and myocardium(r=0.859、0.809,P＜0.05).ConclusionNF-κB p65 as well as AngII in blood plasma and myocardium increase during myocardial ischemia-reperfusion injury.

Ischemia-reperfusion injury;Nuclear factor-kappa B;AngiotensinⅡ

2013-08-28）

（本文编辑：杨丽）

315000浙江省宁波市第一医院心内科

杨锐，E-mail：youngrui@hotmail.com