李 剑,任姝娟,李沫蕊,王亚飞 (北京师范大学水科学研究院,地下水污染控制与修复教育部工程研究中心,北京 100875)

北京官厅水库水体甲状腺激素干扰效应检测及特征

李 剑*,任姝娟,李沫蕊,王亚飞 (北京师范大学水科学研究院,地下水污染控制与修复教育部工程研究中心,北京 100875)

应用重组人甲状腺激素受体(hTR)基因酵母快速测试方法,检测北京官厅水库水体类/抗甲状腺激素干扰效应,并分析其地理分布、季节分布特征以及水体甲状腺激素干扰化合物(TDCs)组成特征.结果表明:官厅水库水体检出了显著的抗甲状腺激素干扰效应,与其它研究区域相比,效应处于较低到中等水平;入库河流对库区水质产生显著影响,且入库河流水质受季节影响显著,因此,库区水体不同季节甲状腺激素干扰水平存在差异;C18固相萃取柱对抗甲状腺激素干扰效应的去除率在61.9%～92.3%,表明官厅水库水体中的甲状腺激素抑制活性物质多集中在有机组分,加入30mg/L的EDTA后TR抑制活性显著降低,表明官厅水库水体中TDCs除有机化合物外可能还包含重金属类无机化合物.

重组基因酵母；甲状腺激素干扰化合物；官厅水库；甲状腺激素干扰效应

一些环境化合物具有潜在的甲状腺激素干扰活性,如酚类化合物、农药、持久性有机污染物、溴代阻燃剂等[1].这些具有甲状腺激素干扰活性的化合物通常被称为甲状腺激素干扰物(TDCs),TDCs已成为继环境雌激素之后最重要的一类内分泌干扰物[2].研究证实,TDCs能够伴随人类生产、生活活动进入环境水体,对人类健康和生态安全造成重大威胁.

环境水样TDCs检测方法通常包括生物测试方法和化学分析方法两大类[3].生物测试的结果不仅能够反映环境样品中TDCs的浓度水平,而且能够表征 TDCs的效应特征.其中,重组甲状腺激素受体(TR)基因酵母法是检测环境水样TDCs的一种重要的生物测试方法,具有稳定、经济、高效的特点,且通过该方法能够检测出水体类/抗甲状腺激素干扰效应[4].环境水样通常都要经过复杂的前处理后才能进行分析测定.环境水样 TDCs检测时通常采用的前处理方法包括液液萃取、固相萃取、微波萃取等[5].环境水样前处理通常需要消耗大量有机溶剂,危害环境,且操作时间较长;而且前处理方法在富集、浓缩的过程中也可能造成环境中未知 TDCs的损失,因此测试结果不能反映环境水样甲状腺激素干扰的真实情况.因此,本实验室开发出一套无需复杂样品前处理的环境水样甲状腺激素干扰效应重组基因酵母体外快速测试方法,已证实能够应用于环境水样类/抗甲状腺激素干扰效应的检测[6].

环境水样中的 TDCs按照性质的不同,可分为有机类和无机类.有机 TDCs的研究是目前的热点,水环境中已发现的有机TDCs种类繁多.对于无机TDCs的研究较少,Boas等仅报道高氯酸盐具有甲状腺激素干扰活性[1].早期的研究证实,重金属离子Zn2+、Cu2+、Cd2+也具有抑制甲状腺激素三碘甲状腺原氨酸T3和TR结合的活性[7];特别是 Zn2+,生物学研究已经证实该元素对于调节 TR介导的基因转录具有至关重要的作用[8].但是,目前对于环境水样的研究多集中于有机组分甲状腺激素干扰效应的检测[9-10],鲜见水体无机组分干扰效应的报道.

因此,本研究选择北京官厅水库水体作为研究对象,分枯/丰水期分别采集水样,采用重组基因酵母快速测试方法,考察北京官厅水库水体甲状腺激素干扰效应水平及其季节、地理分布特征.水样经C18柱固相萃取、EDTA处理后分别考察类/抗甲状腺激素干扰效应变化,分析有机组分、无机组分对水体甲状腺激素干扰效应的贡献,初步探讨水体TDCs的组成特征.

1 实验部分

1.1 样品采集

2012年5月和9月分别对北京官厅水库水样进行采集,采样点如图1所示.每个样点采集水样 2.5L,以清洁玻璃瓶盛装;采集后 24h内采用0.7µm玻璃纤维滤膜(Millipore,美国)过滤去除悬浮颗粒物,收集过滤水样0.5L用于改进后的重组基因酵母方法快速测试.2L水样经C18柱(500mg, Waters,美国)固相萃取后收集柱后样品 1L,其中0.5L用于快速生物测试,0.5L添加30mg/LEDTA后用于快速生物测试.

图1 官厅水库采样点示意Fig.1 Sampling sites in the Guanting Reservoir

1.2 重组基因酵母体外快速测试

重组TR基因酵母由中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室提供.改进后的重组基因酵母快速测试方法参考文献[6]进行,可简单描述为:选择对数生长期的酵母细胞,调节细胞密度使得 600nm处的吸光度 OD600nm值为0.75.5mL酵母细胞 1000g离心 5min(Sigma Laborzentrifugen 2K15,德国),弃去上清,加入4.5mL待测水样及0.5mL 10×SD/-Leu/-Trp培养基;检测水样抗甲状腺激素干扰效应时添加12.5µL 10-4mol/L T3(Sigma,美国).30℃振荡培养(130r/min,HZQ-Q,中国)2h后,200µL溶液转移到96孔板中,测定 600nm处的吸光度值(TECAN GENios A-5002,澳大利亚),每个样品设4个平行.每孔吸取 100µL溶液加入新的 96孔板中,加入100µL 反应缓冲液(Tropix, Bedford, MA, USA)30

℃,800r/min,反应 1h,酶标仪测定发光值(TECAN GENios A-5002,Austria).

1.3 数据表征

β-半乳糖苷酶活性值的计算参考文献[9].水样类/抗甲状腺激素干扰效应分别采用相对百分诱导活性P和相对百分抑制活性I表征,计算公式如下:

式中:u为环境水样检测的 β-半乳糖苷酶活性值;umax为T3在最大诱导效应浓度(2.5×10-7mol/L)诱导的β-半乳糖苷酶活性值.根据I值和抗甲状腺激素标准化合物盐酸胺碘酮(AH)的剂量-效应关系,参考文献报道方法计算水样AH当量[6,9].

1.4 质量控制和质量保证

为保证整个样品前处理过程的可靠性,在样品前处理过程中添加空白样品(Mili-Q超纯水),并同步进行生物毒性测试,对整个试验流程进行监控,保证生物测试实验的可靠性[6].样品平行测定3次,在实验过程中严格添加阳/阴性对照并保证标准曲线的日校正.具体步骤如下:

检测环境水样时,每组样品均添加阳性对照和阴性对照.阴性对照均采用 Mili-Q超纯水;类甲状腺激素干扰效应检测时阳性对照选择浓度为2.5×10-7mol/L T3溶液(溶解到Mili-Q超纯水中);抗甲状腺激素干扰效应检测时阳性对照选择2.5×10-7mol/L T3+10-7mol/L AH溶液(溶解到Mili-Q超纯水中).

标准曲线进行日校正.基于阳性对照诱导/抑制酵母细胞酶活性的剂量-效应关系曲线,选取曲线线性部分 2～4个阳性对照浓度对标准曲线进行日校正.

为了去除环境样品急性毒性(主要考虑对酵母的细胞毒性)对诱导/抑制酶活性的影响,添加酵母细胞急性毒性试验.测定600nm处的吸光度,表征酵母细胞密度,与空白对照相判断是否存在显著差异,具有急性毒性的样品不计算其诱导/抑制酶活性[11].

添加样品回收率试验.对于类甲状腺激素干扰效应检测,环境水样中添加 2.5×10-7mol/L T3,回收率的计算公式为(加标样品 T3当量-未加标样品 T3当量)/2.5×10-7mol/L.对于抗甲状腺激素干扰效应检测,环境水样中添加2.5×10-7mol/L T3及 10-7mol/L AH,回收率的计算公式为:(加标样品AH当量-未加标样品AH当量)/10-7mol/L.回收率测试结果大于 125%或小于 65%时,数据不可用[11].

2 结果与讨论

2.1 官厅水库水样类/抗甲状腺激素干扰效应采用快速测试方法对2012年5月和9月采集的官厅水库水样类/抗甲状腺激素干扰效应进行检测,所有测试样品均未检出显著的酵母细胞急性毒性,实验空白控制较好,样品回收率为65.0%～119.9%,平均回收率为90.1%.测试结果如图2所示,5月和9月水样均未检出显著的类甲状腺激素干扰效应,诱导酶活性值与空白对照相比未有显著差异(P<0.05),表明官厅水库水体中未有类甲状腺激素干扰物或类甲状腺激素干扰物的量低于本方法检测限.测试结果与文献报道类似,Li 等[12]对北京饮用水源地及饮用水不同处理工艺出水样品检测时也未发现明显的TR诱导活性;Li 等[9]也报道广州污水处理厂不同工艺出水不具有类甲状腺激素干扰效应.

图2 官厅水库水样类甲状腺激素干扰效应Fig.2 Agonistic thyroid receptor activities of water from Guanting Reservoir

采用快速测试方法对官厅水库水样抗甲状腺激素干扰效应进行检测,测试结果如图3所示.除空白对照外,在官厅水库8个采样点,5月及9月样品中均检测出抗甲状腺激素干扰效应,效应水平采用AH当量进行表征[9].2012年5月官厅水库水样 AH 当量浓度水平在(21.2±1.6)～(313.9±28.8)µg/L;9月官厅水库水样 AH当量浓度范围在(21.0±1.0)～(2147.2±48.1)µg/L.将官厅水库水样抗甲状腺激素干扰效应水平与文献报道值比较发现,官厅库区水体中抗甲状腺激素干扰物浓度处于较低到中等污染水平(表1).

图3 官厅水库水样抗甲状腺激素干扰效应Fig.3 Antagonistic thyroid receptor activities of water from Guanting Reservoir

2.2 官厅水库水样抗甲状腺激素干扰效应分布特征

2012年5月官厅水库水样抗甲状腺激素干扰效应AH当量浓度较高值出现在采样点GR1、GR2和 GR5,当量浓度分别为:(313.9±28.8)、(113.0±4.1)和(188.0±19.6)µg/L;库区内其他采样点 AH当量浓度值在(21.2±1.6)～(47.2±4.7)µg/L,远低于上述3个采样点.其中GR1采自永定河8号桥,反映入库前永定河的水质状况;GR5采自永定河入库口,GR2采自妫水河入库口.永定河和妫水河是官厅水库的两条主要入库河流,永定河 8号桥、永定河入库口、妫水河入库口水样抗甲状腺激素干扰效应远高于官厅库区其他几个采样点的效应值,表明库区抗甲状腺激素干扰物可能来自于永定河、妫水河的输入.康跃惠等[13]研究了北京官厅水库-永定河水系水体中持久性有机氯农药污染,也得出了类似的结论,认为官厅库区水体中有机氯农药来自永定河、妫水河的输入.

2012年9月官厅水库水样AH当量浓度较高值出现在采样点GR1、GR5和GR6,当量浓度分别为:(2147.2±48.1)、(564.3±43.7)和(198.2± 14.8)µg/L.GR6采自永库区,靠近永定河入库口.与 5月采集的样品比较发现,9月来自永定河输入的抗甲状腺激素干扰物的浓度明显增加,永定河8号桥检测到的AH当量浓度值是5月的6.8倍,且该类物质输入浓度的增加,不仅影响到永定河入库口的水质,对于下游永库区的水质也产生了显著的影响.9月由于妫水河出现断流,妫水河入库口水质恢复,与库区其他样点相比抗甲状腺激素干扰效应无显著性差异.整个妫库区的 AH当量浓度值与5月相比略有降低.由此可见,由于入库河流水量、水质受季节影响显著,官厅水库库区水体抗甲状腺激素干扰效应也呈现一定的季节变化规律.

表1 水样抗甲状腺激素干扰效应当量浓度比较Table 1 The antagonistic thyroid receptor activities of water samples collected in different area

综合5月和9月采集样品的测试结果表明,永定河是官厅水库抗甲状腺激素干扰物的重要输入源,对官厅水库水体水质影响较大,应该引起重视.调查发现,官厅水库永定河上游的张家口宣化农药厂、怀来县城的长城化工厂、洋河工业区的废水排放以及生活污染排放可能是永定河污染的重要来源.

2.3 官厅水库水样抗甲状腺激素干扰物组成特征

本文借鉴USEPA建立的废水TIE的方法初步探索官厅水库水体TDCs的组成特征.TIE方法进行毒性鉴定的范围涵盖了氨氮、重金属离子等无机物和各类有机物[16].本文参考该鉴定方法,其中氨氮类化合物根据之前的文献报道及本实验室的测试数据均证实该类化合物不具有TR的干扰活性(数据未列出),因此,重点考察水体中的重金属类无机化合物和有机化合物对毒性的贡献.

图4 固相萃取(SPE)、添加EDTA对官厅水库水样抗甲状腺激素干扰效应的影响Fig.4 Antagonistic thyroid receptor (TR) activities of the original water, residual water after the solid-phase extraction (SPE) and the treatment water after addition the EDTA

选择2012年5月采集水样,采用固相萃取方法(SPE),选用C18固相萃取柱对水体中的非极性有机组分进行富集,考察水样萃取前后甲状腺激素干扰效应的改变.测试结果表明萃取后的水样仍未检出显著的类甲状腺激素干扰效应(数据未列出).但是,萃取后水样的抗甲状腺激素干扰效应显著降低(如图 4);C18固相萃取柱对水样抗甲状腺激素干扰效应的去除率在 61.9%～92.3%,表明官厅水库水体中的抗甲状腺激素干扰化合物多为有机化合物,集中在有机组分中.Boas等[1]报道证实目前已筛选出大量具有抗甲状腺激素干扰效应的有机化合物,比较典型的有多氯联苯、溴代阻燃剂、邻苯二甲酸酯等.Li等[10]及Shi等[14]对我国饮用水源水甲状腺激素干扰效应调查发现,邻苯二甲酸酯是水体主要的抗甲状腺激素干扰物.

样点GR1、GR2和GR5经萃取后的抑制效率与空白对照之间存在显著性差异(P<0.05),表明C18固相萃取柱不能完全去除水体中的抗甲状腺激素干扰物;官厅水库水样中除有机化合物外可能存在其他的抗甲状腺激素干扰物.因此,向测试体系中加入30mg/L的EDTA(实验证实该浓度对测试体系酶活性无影响,数据未列出),去除水样中的重金属离子,观察水样干扰效应的变化.测试结果如图4,加入EDTA后水样GR1、GR2和GR5抗甲状腺激素干扰效应明显降低,与空白对照相比无显著差异,由此可初步推断,官厅水库水样中抗甲状腺激素干扰物除有机化合物外可能包含重金属类无机化合物.Surks等[7]报道证实重金属离子Zn2+、Cu2+、Cd2+能够抑制甲状腺激素T3和TR结合,特别是Zn2+在1µmol/L时即表现出显著的抑制活性,添加重金属螯合剂EDTA后能够终止重金属离子的抑制活性,促进甲状腺激素诱导的基因转录.

3 结论

3.1 官厅水库水体未检出类甲状腺激素干扰效应,但是具有抗甲状腺激素干扰效应,与文献报道相比,干扰效应处于较低到中等水平.

3.2 入库河流对官厅水库库区水体抗甲状腺激素干扰效应影响显著,且入库河流水质、水量受季节影响,因此,库区水体不同季节甲状腺激素干扰水平也存在差异;库区水体甲状腺激素干扰效应水平虽然相对较低,但是存在新的污染输入,如果恢复为北京的饮用水源地,则应该引起重视.

3.3 官厅水库水体中具有抗甲状腺激素干扰效应的化合物除了有机化合物外,一些无机组分如重金属离子等,也可能产生甲状腺激素的干扰作用;由此可见,仅仅研究环境样品有机组分的甲状腺激素干扰效应,不能反应环境样品对甲状腺系统干扰的真实水平.

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联合国环境规划署为环境保护部部长周生贤颁发“环境政策与领导贡献奖”

首届联合国环境大会高级别会议2014年6月26日在肯尼亚内罗毕开幕.会议期间,联合国授权联合国副秘书长兼环境规划署(以下简称“环境署”)执行主任施泰纳向周生贤颁发“环境政策与领导贡献奖”.

施泰纳高度赞赏中国政府在防治污染、发展经济和保护生态环境方面所做的努力.他表示,作为世界上最大的发展中国家,中国积极推进绿色经济和生态文明,践行绿色发展、低碳发展和循环发展,在治理环境污染,特别是大气、水、土壤污染防治,以及防止环境退化方面做出了巨大努力.中国还积极参与和推动国际环境治理及南南合作,中国在这些方面所取得的成就为世界所瞩目.为表彰周生贤部长在推动中国环境保护事业和推进全球可持续发展进程中所发挥的杰出领导作用,联合国授权环境署向周生贤部长颁发此奖项.

周生贤表示,这一奖项不仅是对其个人和环境保护部的莫大鼓励,也是对中国政府为保护环境、发展绿色经济、推动全球可持续发展所做工作的充分肯定,荣誉属于国家和人民.中国政府历来高度重视环境保护,把环境保护确立为基本国策.近年来,更是把环境保护摆上更加突出的战略位置,站在推进国家生态环境治理体系和治理能力现代化的高度,着力构建推进生态文明建设和环境保护的四梁八柱,各项工作取得积极进展.但是,中国在发展中不平衡、不协调、不可持续问题依然突出,中国的环境保护工作仍然任重而道远.中国愿继续加强与环境署的合作,与世界各国一道,共享发展机遇,共迎环境挑战,共同建设人与自然和谐发展的地球家园

摘自《中国环境报》

2014-06-27

Thyroid disrupting effects characterization of water from Guanting Reservoir, Beijing, China.

LI Jian*, REN

Shu-juan, LI Mo-rui, WANG Ya-fei (Engineering Research Center of Groundwater Pollution Control and Remediation, Ministry of Education, College of Water Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China). China Environmental Science, 2014,34(7)：1884～1889

A rapid recombinant human thyroid hormone receptor (hTR) gene yeast bioassay was used to evaluate the thyroid disrupting effects in the water from the Guanting Reservoir (GR), Beijing, China. Furthermore, the geographic and seasonal distribution, and thyroid disrupting chemicals (TDCs) composition characteristics of water were analysed. The results revealed that water samples had TR antagonistic activities. The Guanting Reservoir water displayed a low to moderate effect on thyroid hormone signalling, which was impacted by the input river. The effects of the input river were significantly affected by season, so the effects of reservoir water were temporally variable. A solid phase extraction by C18cartridges was used to separate the organic extracts, which eliminated 61.9%～92.3% antagonistic activities, suggesting the organic extracts may play a major role in the TR disruption effect of the water. After addition of EDTA (30mg/L) to the residual water samples, the antagonistic activities decreased significantly, showing the metals might contribute to the TR antagonistic activity.

recombinant gene yeast；thyroid disrupting chemicals；Guanting Reservoir；thyroid disrupting effects

X703.5

A

1000-6923(2014)07-1884-06

李 剑(1980-),女,重庆人,副教授,博士,主要从事水生态毒理学研究.发表论文40余篇.

2013-10-10

国家自然科学基金资助项目(41001351);中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(2012LYB35);高等学校博士学科点专项科研基金资助课题(20100003120024)

* 责任作者, 副教授, lijian@bnu.edu.cn