许明录,高明,刘东涛,李倩,李粉

（河南科技学院,河南新乡453003）

续断菊（Sonchus asper（L.）Hill）一年两生草本菊科植物,俗称花叶滇苦菜.直立高 50~100 cm,下部无毛,中上部及顶端有稀疏腺毛.叶片长椭圆形或倒圆形,长6~15 cm,宽1.5~8 cm,不分裂或羽状全裂,边缘有不等的刺状齿.味苦、性寒,具有清热解毒、止血的药用功效；可内服也可外用,资源遍布于全国各地,亦可作为野菜食用[1].杨梅素具有降血糖、抗氧化、保护肝脏、抗血栓、抗心肌缺血、改善微循环等多方面的药理作用.续断菊是一种常见的具有良好药用价值的天然植物,对其各种特性的研究国内外有很多报道.例如：抗病菌作用[2]、对除草剂的敏感性[3]、对其染色体及核型的研究[4]等.迄今对续断菊主要化学成分的研究文献也有不少报道,已陆续从续断菊中分离出倍半萜内酯苷、紫罗兰酮衍生物苷[5]；木栓醇乙酸酯,豆甾醇,芹菜素,木犀草素及其7-葡糖醛酸等物质[6].并且黄酮类、黄酮醇类、总酚、原花青素等物质的含量相对较多；但是皂苷、生物碱类物质含量相对较少[7].目前提取天然产物的主要方法有连续回流提取法、超临界流体提取法、超声波提取法、微波提取法等,分离多采用液-液萃取、液液分配柱色谱、膜分离技术[8]等方法.

本试验将采集干燥后的续断菊采用连续热回流提取法、液-液萃取法将其有效成分提取分离出来,经HPLC进一步纯化后LC-MS进行定性检测分析.

1 仪器与试剂

1.1 供试材料和试剂

供试续断菊于2012年10月采自新乡市河南科技学院周边田间,经河南科技学院许桂芳教授鉴定.

甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、水为超纯水.其他分析纯试剂均为天津市科密欧化学试剂有限公司生产.

1.2 主要仪器

1.2.1 LC6-AD高效液相色谱仪条件 色谱柱：YMC-Pack Pro,C18 100×4.6mm,S-3μm,12 nm；流动相流速1.0mL/min；波长280 nm；流动相A：超纯水用水系滤膜过滤,超声波震荡30min除气泡；流动相B：乙腈（色谱纯）用有机系0.22μm过滤薄膜过滤配成83%的溶液（V（乙腈）∶V（水）=83∶17）；进样量10μL.1.2.2 LCQ Deca XPMAX液相色谱-质谱联用仪条件 Surveyor LCPump Plus液相四元泵,带内置真空脱气机；Surveyor PDA PlusDetector二极管阵列检测器；电喷雾ESI离子源.

2 方法与结果

2.1 样品制备

将田间采来的续断菊自然晒干称重后,用体积分数95%的乙醇加热回流提取3次（5 L×3,每次24 h）,合并提取液减压浓缩蒸干.浓缩物用适量水溶解后,按极性递增方式依次用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取（V（水）∶V（有机溶剂）=1∶1）,每种有机溶剂重复3次浓缩蒸干.共得到续断菊5个层的提取物质,取少量乙酸乙酯层提取物,称重后用甲醇溶解配成5 000 g/L的溶液用于HPLC后续的分离纯化.

2.2 色谱条件优化

因此次续断菊提取物未上柱处理,所制备的5 000 g/L溶液中含有较多极性不一、相对分子质量跨度大的物质,分离纯化较困难.故采用梯度洗脱的方法,对其有效成分进行分离.但因所含物质较多,探寻一条理想的方法比较困难；前期进行一系列的方法探索.

利用前期探索方法,得到较好分离度的馏分较少,还需继续优化洗脱程序.经多次探索后,寻找到一种能得到较好分离度的方法（见表1）.

表1 HPLC梯度洗脱程序Tab.1 HPLC gradient elution program

2.3 物质分离纯化

利用表1梯度洗脱程序将配好的溶液用HPLC分离纯化,进样量10μL.得到5个较好分离度的馏分（见图1）,在机器重现性好的情况下进样收集,分别编号标记.

图1 HPLC溶液分离纯化Fig.1 HPLC solution separation graph

2.4 收集馏分样品的LC-MS测定

将得到的5个较好馏分稀释后,在正离子模式下直接进样用LC-MS进行电喷雾质谱检测,进样量2μL,检测结果质谱图见图2.

图2 LC-MS检测质谱图Fig.2 LC-MS graph

馏分1的分子式C15H20O8,相对分子质量为318,溶于甲醇、乙醇.LC-MS测得馏分1的分子离子峰为[M+H]+319,主要碎片离子为m/z195、m/z125、m/z108,裂解情况如图3所示.以上数据与文献[9]报道的杨梅素一致,故推断该化合物为杨梅素.

图3 杨梅素的结构及其裂解情况Fig.3 Structure and decomposition of myricetin

3 结论

因提取物未上柱,其中所含有较多结构不同、极性不一的物质.分离时需采用梯度洗脱程序,这样能够收集到更多的纯馏分.馏分进行LC-MS检测,与查阅的关于杨梅素的结构特点相比较,本文通过LC-MS联用仪测得的馏分1和杨梅素结构相吻合,故鉴定出馏分1为杨梅素；其他馏分因实验方法未能定性出其准确结构.本研究一方面从化学成分层面上,了解续断菊的主要化学成分有助于客观地评价其药用价值；另一方面,通过对续断菊提取物进行分离,可以为其进一步的分离提供有效的可参考的实验方法,也为续断菊的研究开发和新药的研究奠定了基础.

[1]高向阳,张娜,史可夫.不同生长期续断菊中氨基酸柱前衍生RP-HPLC同时测定及营养特性比较[J].广东农业科学,2013（12）：111-114.

[2]许桂芳,王鸿升,刘明久.外来植物续断菊的化感作用研究[J].河南师范大学学报,2011,39（5）：141-144.

[3]张媛媛,罗小勇.三十五种菊科植物对吡氟禾草灵的敏感性差异[J].植物保护学报,2010,37（6）：557-561.

[4]杨得奎,李法曾,周俊英,等.续断菊的染色体研究[J].山东师大学报,1995,10（4）：429-431.

[5]Shimizu S,Miyase T,Ueno A,et al.Sesquiterpene lactone glycosides and ionone derivative glycosides from Sonchus asper[J].Phytochemistry,1989,28（12）：3399-3402.

[6]沈珊梅.续断菊的化学成分[J].国外医学：药学分册,1980（2）：121.

[7]Jimoh FO,Adedapo A A,Afolayan A J.Comparison of the nutritive value,antioxidant and antibacterial activities of Sonchus asper and Sonchus oleraceus[J].Records of Natural Products,2011,5（1）：29-42.

[8]王姣,姜忠义,吴洪,等.中药有效成分和有效部位分离用膜[J].中国中药杂志,2005,30（3）：165-170.

[9]张元媛,贾晓妮,曹永翔,等.黄蜀葵花化学成分研究[J].西北药学杂志,2008,23（2）：80-82.