BRCA1基因启动子区甲基化状态抑癌作用研究

2014-05-06孙勇李运辉张鹏

海南医学 2014年12期

关键词：甲基化乳腺淋巴结

孙勇，李运辉，张鹏

(莱芜市人民医院普外科，山东莱芜 271100)

·论著·

BRCA1基因启动子区甲基化状态抑癌作用研究

孙勇，李运辉，张鹏

(莱芜市人民医院普外科，山东莱芜 271100)

目的研究BRCA1基因启动子区甲基化状态在乳腺癌组织中的抑癌作用。方法甲基化PCR法检测60例乳腺癌患者的癌组织、癌旁组织和20例乳腺良性组织中BRCA1-mRNA表达及启动子区甲基化状态，以及评价其作用。结果癌组织和癌旁组织中BRCA1-mRNA的表达水平分别为(0.612 2±0.234 4)、(0.687 5±0.257 6)，在癌组织、癌旁组织、良性肿瘤组织中BRCA1表达的甲基化率分别为70.0%、48.3%、35.0%。癌组织的甲基化率明显的高于癌旁组织和良性肿瘤组织；经统计学分析显示，淋巴结转移、肿瘤分级在BRCA1-mRNA表达及启动子区甲基化中的差异均具有统计学意义(P＜0.05)，绝经、组织分型在BRCA1-mRNA表达及启动子区甲基化中的差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论BRCA1-mRNA表达及启动子区甲基化状态在乳腺癌的发生发展中起着重要的作用，并且与组织分期和淋巴结的转移密切相关。

乳腺癌；BRCA1基因表达；启动子区；甲基化

乳腺癌是临床上常见的女性恶性肿瘤之一，乳腺癌的发展是一个多因素、多阶段的综合过程。目前，临床上对乳腺癌的研究报道较多，对其病因的研究已经有一定的了解[1]。BRCA1是卵巢癌和乳腺癌特异性抑癌基因，其在细胞周期传导信号的过程中具有十分重要的作用。在正常的卵巢组织和乳腺中该基因会正常表达，而在卵巢癌或乳腺癌中则会缺失或下降[7]。本文旨在研究BRCA1-mRNA表达及启动子区甲基化状态在乳腺癌组织中的抑癌作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取我院普外科2007年6月至2013年6月住院的60例乳腺癌患者，年龄35～75岁，平均(55±11.797)岁。经病理学诊断，侵入性导管癌40例、鳞状上皮癌10例、浸润小叶癌5例、叶囊性肉瘤5例，同时选取我院乳腺检查正常的乳腺良性组织20例。用电泳法提取乳腺癌患者血液组织中DNA，用分光光度仪定量后，在-20℃保存待用。

1.2 诊断及排除标准所有患者均符合乳腺癌筛查规范化诊断标准和操作方法的乳腺癌临床诊断标准以及符合伦理道德，家属或者患者签署了知情同意书等。排除标准[3]：①患有其他重要的器官衰竭性疾病，或者内分泌性疾病，比如肝肾衰竭、糖尿病等；②正在服用可能影响研究效果和结局药物的患者；③具有严重神经精神疾病的、意识不清不能参加随访的患者。剔除标准[4]：①凡对试验的调查研究不依从、不配合、容易产生失访的以及拒绝参加试验者都应剔除；②试验过程中不按照规定进行检查，或者在调查过程中采用了其他治疗措施的可能影响试验结果的；③在治疗过程中病情突然加重不能再参加试验的。

1.3 研究方法

1.3.1 BRCA1-mRNA表达水平的检测(1)RNA提取：选择FASTAGEN-RNAFAST200试剂盒(由飞捷生物公司生产)提取组织中的RNA，利用紫外分光光度法对RNA的纯度和浓度进行测定，放在温度为-20℃的恒温箱里保存。（2）RT-PCR的检测：对RNA进行逆转录。用半定量PCR扩增cDNA，PCR是25 L反应体系，反应条件包括：①内参照94℃4 min，72℃30 s，55℃30 s，共循环30次。②BRCIA：94℃5 min，52℃30 s，72℃30 s，55℃30 s，72℃7 min，共循环30次。

1.3.2 BRCA1基因启动子区的甲基化状态(1) DNA的提取：采用酚-氯仿手工法提取组织中的DNA，利用紫外分光光度法对RNA的纯度和浓度进行测定，放在温度为-20℃的恒温箱里保存。(2)基因组DNA的亚硫酸氢钠修饰：将DNA 2 μl置于1.5 ml EP管中，稀释至50 μl，加苯二酚10 mmol/L和亚硫酸氢钠3.6 mol/L，容易避光、均匀混合，并加200 μl石蜡油，避免氧化和水分蒸发，在50℃的条件下，水浴16 h。

1.4 观察指标BRCA1-mRNA表达在各种细胞中表达水平；BRCA1-mRNA表达的下降率；甲基化率。在不同的组织分级、有无转移、绝经、激素受体(ER)、孕激素受体(PR)中BRCA1-mRNA表达的差异情况。

1.5 统计学方法应用SPSS13.0软件进行数据分析，计量资料以均值±标准差()表示，对于符合正态分布，方差齐性的资料应用两组之间的t检验，对于符合条件的多个均值之间的比较应用方差分析；计数资料采用百分比表示，应用χ2检验，χ2检验三者之间有意义后，再采用SNK-q检验进行两两之间的比较。检验水准取α=0.05，当P＜0.05时差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BRCA1-mRNA在不同细胞中的表达经过PCR分析后癌组织和癌旁组织中BRCA1-mRNA的表达水平分别是(0.612 2±0.234 4)、(0.687 5±0.257 6)，而在乳腺良性肿瘤的组织中表达水平是(0.996 5±0.045 0)，明显高于癌组织和癌旁组织，统计学检验后，其差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图1。

图1 BRCA1-mRNA在癌组织、癌旁组织、良性肿瘤的表达水平

2.2 三种乳腺组织BRCA1表达的甲基化率比较癌组织、癌旁组织、良性肿瘤组织BRCA1表达的甲基化率分别为70.0%、48.3%、35.0%。癌组织的甲基化率明显高于癌旁组织和良性肿瘤组织。三者甲基化率经过χ2检验，差异具有统计学意义(χ2=9.766，P=0.008)，再经过两两比较，癌组织与癌旁组织之间差异无统计学意义(χ2=5.829，P=0.016)，而癌组织和良性组织之间差异具有统计学意义(χ2=7.742，P= 0.005)，见表1。

表1 三种乳腺组织中BRCA1表达的甲基化比较（例）

2.3 乳腺癌组织中BRCA1-mRNA表达及启动子区甲基化状态与病理指标的相关性经统计学分析，淋巴结转移、肿瘤分级在BRCA1-mRNA表达及启动子区甲基化中的差异均具有统计学意义(P＜0.05)，绝经、组织分型在BRCA1-mRNA表达及启动子区甲基化中的差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 乳腺癌组织中BRCA1基因启动子区甲基化与病理指标的相关性

3 讨论

乳腺癌是乳腺上皮组织发生的恶性肿瘤，超过了99%的乳腺癌患者为女性。目前临床上对乳腺癌的发病机制研究结果尚未明确，有研究表明，乳腺癌的发生具有一定的规律性，其中，乳腺癌家族史、月经初潮过早等是乳腺癌发病的高危因素[5]。通常情况下乳腺癌没有明显的临床表现，不容易引起患者的重视，往往在乳腺癌筛查或体检的时候才会发现。BRCA1基因是卵巢癌和乳腺癌特异性的一种抗癌基因，基因的改变和卵巢癌、乳腺癌的发生发展密切相关。在乳腺癌组织中，关于BRCA1基因突变的报道较少，基因的杂合性丢失频率也较低。近年来，国内外大部分研究发现[6]，在卵巢癌或乳腺癌中BRCA1有较高的甲基化频率，且该基因的异常化改变只在卵巢癌和乳腺癌中有变化，而在肝癌、结肠癌、食管癌以及白血病等恶性肿瘤中均不发生甲基化。Deshmukh等[7]用甲基化特异性检测法MSP对乳腺癌的引流液进行检查，结果显示BRCA1启动子区异常甲基化的频率达到了39%。另有谢飞等[8]对20例乳腺癌患者BRCA1中CPG岛中的30个CPG位点的基因转录水平和甲基化情况进行研究，结果证实CPG岛甲基化和抑制基因转录有着密切的关系。

BRCA1基因在正常卵巢组织和乳腺癌上皮组织中高表达，临床上对BRCA1-mRNA表达水平降低的原因主要以基因突变、启动子区甲基化以及杂合性丢失。目前，国内用RT-PCR检测乳腺癌组织中的BRCA1-mRNA表达水平尚没有明确报道。汤靓等[9]用RT-PCR检测法表明，BRCA1-mRNA在乳腺癌上皮组织中及癌旁正常组织中的表达均明显低于乳腺良性组织中的表达。在组织分级中，分级越低BRCA1-mRNA的表达下降率越低，而分级率越高其表达率也随之升高，其中T3的下降率达到了60%。此外，有淋巴结转移的乳腺癌组织中该基因的表达下降率为39%[10]，无淋巴结转移的乳腺癌组织中，BRCA1-mRNA的表达下降率为28%，表明BRCA1-mRNA的表达下降与有无淋巴结转移密切相关。但是BRCA1-mRNA的表达与绝经、P53，肿瘤组织分型等无关[10]。

本研究通过对60例乳腺癌组织中BRCA1-mRNA组织中BRCA1和mRNA表达及启动子区甲基化状态进行检测，结果显示，癌组织和癌旁组织中BRCA1-mRNA的表达水平分别是(0.612 2±0.234 4)、(0.687 5±0.257 6)，癌组织、癌旁组织、良性肿瘤组织BRCA1表达的甲基化率分别为70.0%、48.3%、 35.0%。癌旁组织的甲基化铝明显的高于癌旁组织和良性肿瘤组织；经过检验淋巴结转移、肿瘤分级在BRCA1-mRNA表达及启动子区甲基化差异有统计学意义，绝经、组织分型在BRCA1-mRNA表达及启动子区甲基化中比较差异有统计学意义。这一结果提示BRCA1-mRNA的表达水平在正常乳腺癌组织中没有异常变化，而在乳腺癌组织中明显降低，且与淋巴结的转移和组织分型相关。

对BRCA1-mRNA表达及启动子区甲基化状态在乳腺癌组织中抑癌作用的研究，有助于对乳腺癌中抑癌基因失活的遗传学机制进行充分阐明。DNA甲基化的改变具有乳腺癌肿瘤细胞的特异性，甲基化的表型在恶性表型出现之前，因此，在确诊肿瘤之前，可以对甲基化阳性的抑癌基因进行检测。

综上所述，BRCA1-mRNA表达及启动子区甲基化状态在乳腺癌的发生发展中起着重要的作用，并且与组织分期和淋巴结的转移密切相关，这一结果对乳腺癌的临床诊断的治疗具有重要参考价值。

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Effect of BRCA1 promoter methylation on tumor inhibition.

SUN Yong,LI Yun-hui,ZHANG Peng.
Department of General Surgery,Laiwu People's Hospital,Laiwu 271100,Shandong,CHINA

>ObjectiveTo study the effect of BRCA1 promoter methylation on tumor inhibition in breast cancer tissue.MethodsBRCA1-mRNA expression and promoter methylation were detected by methylation PCR in 60 cases of breast cancer tissue,pericarcinous tissue,and 20 cases of benign mammary gland tissue.Meanwhile,its effect was evaluated.ResultsThe expression of BRCA1-mRNA levels in the cancer tissue and pericarcinous tissue were(0.612 2±0.234 4)and(0.234 4±0.257 6),respectively.The methylation rate in cancer tissure,pericarcinous tissue and benign tumor tissue were 70.0%,48.3%and 35.0%,respectively.And the methylation rate in cancer tissue was significantly higher than those in pericarcinous tissue and benign tumor tissue.The differences of lymph node matastasis and tumor classification in BRCA1 mRNA expression and promoter methylation were statistically significant (P＜0.05),while there was no difference in menopause and histological stages in BRCA1 mRNA expression and promoter region methylation(P＞0.05).ConclusionBRCA1 mRNA expression and promoter region methylation status play an important role in the development of breast cancer,and are closely related to the histological stages and lymph node metastasis.

Breast cancer;BRCA1 gene expression;The promoter region;Methylation

R737.9

1003—6350（2014）12—1717—03