李丽秀　赖钟雄

摘 要 以早钟6号枇杷试管苗叶片为试验材料，采用同源克隆方法从叶片mRNA中分离得到CAT基因的2个成员Ej-CAT1和Ej-CAT2，Ej-CAT1 cDNA序列全长1 738 bp，包括1 479 bp ORF和257 bp 3′-UTR；Ej-CAT2序列全长1 742 bp，包含1 479 bp ORF及261 bp 3′-UTR。2个CAT基因成员的核苷酸序列相似性为98.04%，其开放阅读框推导的氨基酸序列具有97.32%的相似性。生物信息学分析结果表明：2个蛋白均编码492个氨基酸，是亲水蛋白，不含信号肽，不存在螺旋卷曲结构，是非跨膜蛋白，亚细胞定位于过氧化物酶体；Ej-CAT1及Ej-CAT2蛋白分别有18、17个功能位点，22、19个磷酸化位点。CAT基因在枇杷试管苗离体保存过程中不同时期具有不同的表达量，整体趋势呈“W”形状，在离体保存1个月时表达量最高，保存7个月时表达量最低。CAT表达量变化可能跟枇杷试管苗的生长发育模式有关。

关键词 枇杷；试管苗；CAT；基因克隆；表达分析

中图分类号 S667.3 文献标识码 A

过氧化物酶（Hydrogen Peroxidase）又称触酶（CAT，Catalase），广泛存在于动物、植物及微生物中。过氧化物酶是最早发现与植物种子活力有关的氧化酶之一[1]，能参与活性氧代谢过程，催化H2O2分解为H2O和O2，防止细胞过氧化；能催化分解甲酸盐、亚硝酸及过氧化乙醇[2-6]。CAT能与SOD、POD组成活性氧防御系统，在植物防御、延缓衰老等方面起着重要作用，能够控制细胞内的氧化还原平衡，与植物的抗旱、胁迫应答（耐盐胁迫、耐温度胁迫）、抗病及减轻重金属等有关[7-8]。此外，CAT在食品工业、纺织、造纸、环保、医药等行业中得到广泛应用[7-12]。

许多研究表明，CAT基因是多基因家族，不同成员在植物中的分布及功能有差异，具有组织差异性表达特点。1997年，Willekens等[12]从烟草中克隆得到3种CAT同工酶，并报道了cat1主要是清除光呼吸产生的H2O2，cat2可能特异的清除氧化胁迫产生的H2O2，而cat3主要是清除乙醛酸循环体中脂肪酸产生的H2O2。Shikanai[13]及Miyagawa[14]等报道了烟草叶绿体中的CAT表达增强了对光、干旱等氧化胁迫的抗性。John G等[15]报道了将CATs转化其他物种，能提高植物对某些逆境的适应性。程华等[16]从银杏中分离得到GbCAT1，其在叶、根、茎、果中均有表达，且表达量受渗透压、ABA、紫外、温度胁迫等影响。梁国庆等[17]研究发现高钙处理12 h和低钙处理24 h，苹果CAT1基因表达量显著增加，且不完全受钙调控。王凤德等[18]报道了豌豆CAT在烟草中的过量表达，提高了烟草的抗旱性及抗氧化性。齐兴柱等[19]从香蕉中分离得到2个CAT基因，并发现其在氧化胁迫环境中起主要作用。林星谷等[20]从冬枣果实中分离得到ZjCAT基因，该基因在冬枣果实成熟衰老中具调控作用。杨芳[21]研究发现豌豆CAT转化玉米提高了玉米的抗旱性。余迪求[22]发现过氧化氢酶在转基因马铃薯中的过量表达，能提高马铃薯的抗病性。在南瓜中得到3个CAT基因成员，拟南芥也有3个CAT基因成员，小麦至少有3个CAT成员等。

目前CAT基因的研究领域涉及植物、动物及微生物，花椰菜、银杏、苹果、香蕉、冬枣、金丝桃、玉米、巴西橡胶、豌豆、小麦、番茄、甘蔗、萝卜、南瓜、辣椒、水稻等植物[11，16-35]CATs基因均已被克隆出来，并做了相应的分析研究，但在枇杷上还未见报道。为了进一步研究CAT在枇杷试管苗离体保存以及其它生长发育过程中的作用，本试验以枇杷试管苗为材料，采用同源克隆方法，从中克隆得到CAT基因的2个成员Ej-CAT1、Ej-CAT2的全长序列，并对其进行序列分析和结构预测；同时，对该基因在离体保存过程中6个不同时期的表达进行定量分析，为进一步研究其功能和调控途径奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

早钟6号枇杷试管苗，由福建农林大学园艺植物生物工程研究所保存。选取生长旺盛的试管苗的叶片作为试验材料。试管苗离体保存材料接种在1/3 MS+PP333的培养基上，取材时间分别为保存1、4、5、7、9及11个月。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计及合成 根据Gnebank上已登录的其他物种CAT cDNA序列，设计保守区引物T1F、T1R；应用得到的保守区序列，设计3′端、5′端扩增引物P2F、P3F和P4R、P5R；根据拼接的cDNA全长序列，在其起始密码子和终止密码子处分别设计引物ORF-F、ORF-R，验证开放阅读框。定量表达分析的引物在CAT ORF内设计，设计的引物委托北京六合华大基因科技股份有限公司合成。各引物序列及其PCR扩增时所用参数见表1所示。

1.2.2 目的片段的扩增 以合成的cDNA第一链为模板，进行保守区扩增及3′ RACE；以cDNA第二链为模板，进行5′端扩增。PCR反应体系：cDNA模板1μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，加ddH2O 9.5 μL至总体积25 μL。反应程序如下：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，按表1所示温度退火1 min，72 ℃延伸t min[表1所示时间（t）]，从变性到延伸共35个循环，最后再72 ℃延伸10 min结束反应，

1.2.3 目的片段的回收、连接转化及序列测定

用DNA回收试剂盒回收目的片段，将目的片段与PMD-18T载体连接并转化DH5α感受态细胞，转化产物涂在含有1 μL Amp ∶ 1 mL LB的平板中培养，12～16 h后挑起单菌落进行重组子菌液鉴定，阳性克隆子送到北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

1.2.4 生物信息学分析 用GenBank上的Blast检索已有序列与分析其保守结构域，采用DNAMAN 6.0和primer 5.0软件进行引物设计、序列拼接及翻译氨基酸。用ExPASy（http：//www.expasy.ch/toos.html）数据库中的ProtParam工具和ProtScale工具预测分析推测蛋白质的理化性质，蛋白质跨膜结构预测与分析采用TMPRED（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html），磷酸化位点预测用NetPhos2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos），利用MEGA 5.0构建系统进化树。

1.2.5 荧光定量分析 将枇杷试管苗接种在1/3 MS+4.0 mg/L PP333+30 g/L白糖的培养基上，分别取保存时间为1、4、5、7、9、11个月的材料提取总RNA，按TaKaRa公司的PrimeScriptR RT reagent Kit说明书逆转录成cDNA。荧光定量以Actin基因为内参对照，在枇杷CAT基因最保守的地方设计引物，引物序列见表2。采用两步法qRT-PCR，反应体系为SYBRR Primer Ex TaqTMⅡ（2×）10.0 μL，PCR Forward Primer 0.8 μL，PCR Reverse Primer 0.8 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O 7.4 μL。反应程序为，95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共40个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min；40 ℃ 30 s。每个反应重复3次，以6个时期的cDNA混样稀释5倍梯度制作标准曲线，并得到各个Ct值，最终计算CAT基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 枇杷CAT基因保守区的克隆

以枇杷保守区cDNA为模板，用引物T1F、T1R进行保守区PCR扩增，得到2条731 bp的相似序列（图1-A），与预期结果相符合，将其命名为CAT1、CAT2。经NCBI比对，发现CAT1、CAT2核酸序列与碧桃、甜樱桃、葡萄、枣、杨树、蓖麻、荔枝、龙眼等CAT的相似性均在80%以上，与碧桃的相似性在90%以上；CAT1、CAT2推导氨基酸序列与桃、枣、杨树、李、葡萄、金丝桃等相似性在85%以上，故推断CAT1、CAT2均是枇杷CAT基因的保守区序列。

经DNAMAN 6.0比对CAT1、CAT2核酸及氨基酸序列，结果见图2。从图2可知，两核酸序列相似性为96.58%，在中间部位有25个不同碱基，氨基酸相似性为95.47%，含有11个不同氨基酸。

2.2 枇杷CAT基因的3′、5′末端的获得与ORF分析

2.2.1 枇杷CAT基因的3′、5′末端的获得 以保守区cDNA第一链为模板，将引物P2F、P3F与通用引物3P、3NP配对进行巢式PCR扩增。第二轮PCR扩增产物经胶回收、连接转化及测序得到2条序列，其扩增产物电泳图见图1-B，序列长度分别为578、582 bp。经DNAMAN6.0 比对，发现得到的2条序列均与保守区序列有重叠部分，能够拼接起来，故推断2条序列均为枇杷CAT的3′序列。以5′cDNA为模板，用引物P4F、P4R多次克隆枇杷CAT的5′RACE，均未能得到序列，重新比对GenBank中其它物种的CAT基因序列后发现，CAT基因在起始密码子处高度同源，故在CAT基因的起始密码子处设计1条顺式上游引物T5F，以5′cDNA为模板，T4F、T5F为引物进行PCR扩增反应，扩增得到1条750 bp左右的目的条带（图1-C）。测序得到1条722 bp大小的序列，与保守区序列拼接有一段高度重叠部分，说明得到的序列是CAT基因的5′端序列。

2.2.2 枇杷CAT基因ORF分析 将所得的5′端序列、保守区序列与3′端序列拼接起来，得到2条全长序列，分别命名为Ej-CAT1、Ej-CAT2，GenBank登录号分别为：JX307086、JX307085。Ej-CAT1 cDNA序列全长1 738 bp，包括1 479 bp ORF及257 bp 3′-UTR，Poly（A）尾长19 bp；Ej-CAT2 cDNA序列全长1 742 bp，包括1 479 bp ORF及261 bp 3′-UTR，Poly（A）尾长23 bp。在Ej-CAT1、Ej-CAT2序列的起始密码子和终止密码子处各设1条引物，进行PCR扩增，扩增得到2条1 500 bp左右的条带（图1-D），经测序得到2条1 479 bp的相似序列，分别与Ej-CAT1、Ej-CAT2的开放阅读框序列一致，进一步验证了Ej-CAT1、Ej-CAT2序列的准确性。

2个CAT基因成员的核苷酸序列相似性为98.04%，其开放阅读框推导的氨基酸序列具有97.32%的相似性。NCBI比对发现，2个CAT ORF序列与碧桃、甜樱桃、枣、葡萄、毛果杨、橡胶树、龙眼、棉花等其他物种的覆盖度多在99%以上，相似性在80%以上。将CAT1、CAT2翻译的氨基酸在线Blast，发现与碧桃CAT氨基酸的同源性为89%，与葡萄、枣、毛果杨、拟南芥的相似性分别为89%、88%、87%、83%，与其他物种的CAT氨基酸的相似性也在80%以上，属于Catalase-like超级家族，由此判断2个序列均为枇杷CAT的cDNA序列。

2.3 枇杷CAT的生物信息学分析

2.3.1 蛋白质的理化性质预测与分析 由预测结果可知Ej-CAT1蛋白翻译492个氨基酸，分子总量为56 991.2，等电点pI为6.66，带正电荷（Arg+Lys）与带负电荷（Asp+Glu）氨基酸残基总数分别为57、61。该蛋白含有20种氨基酸，其中Phe、Pro、Val 3种氨基酸的含量最多，均占7.1%；Cys、Met的含量最少，仅占全部氨基酸的1.2%。其分子式为C2 586H3 869N715O727S1，原子总数为7 909，不稳定指标为40.46，说明该蛋白是一个不稳定蛋白。其脂肪系数为71.71，总亲水性值（GRAVY）为-0.520，预测该蛋白是亲水蛋白。

Ej-CAT2蛋白分子总量为57 087.3，等电点为6.65，带负电荷与带正电荷氨基酸残基总数分别为61、57。该蛋白的分子式为C2 594H3 869N715O727S12，原子总数为7 917，不稳定系数为41.57，是不稳定蛋白。其脂肪系数为70.33，总亲水性值（GRAVY）为-0.539，说明该蛋白是一个亲水性蛋白，而且亲水性比Ej-CAT1蛋白的亲水性强。该蛋白翻译的492个氨基酸中共含有20种氨基酸，其中Phe、Pro两种氨基酸的含量最多，占总氨基酸数的7.3%；Cys的含量最少，仅占1.0%，而且其含量低于Ej-CAT1蛋白中的Cys含量。

2.3.2 蛋白质亲水性/疏水性预测 ProtScale分析Ej-CAT1、Ej-CAT2蛋白的亲疏水性，预测结果显示Ej-CAT1蛋白亲疏水性值低于-2.000的氨基酸有36个，最低值为-2.722，位于第375氨基酸处；分值大于+2.000的氨基酸有4个，最大值为第326处氨基酸的+2.667，亲水性氨基酸明显大于疏水性氨基酸，预测该蛋白为亲水性蛋白，与ProtParam工具的预测结果一致。

Ej-CAT2蛋白的预测结果显示，亲疏水性值低于-2.000的氨基酸有33个，最低值是第427氨基酸处，分值为-2.678；分值大于+2.000的氨基酸只有2个，分别位于氨基酸103与186处，其中186处氨基酸的分值最大，分值为+2.233，其亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，预测结果为亲水性蛋白。

2.3.3 蛋白质的磷酸化位点预测 经NetPhos2.0 对枇杷Ej-CAT1蛋白、Ej-CAT2蛋白的磷酸化位点进行预测，结果见图3。从图3-A可知，Ej-CAT1蛋白的Ser、Thr和Tyr都存在磷酸化现象，共具有22个磷酸化位点，其中10个Ser位点，分别位于氨基酸10、14、70、85、104、112、164、347、437、491处；6个Thr位点，分别位于氨基酸97、115、273、292、351、414处；6个Tyr位点，分别位于氨基酸4、221、256、348、392、453处。从图3-B中可知，Ej-CAT2蛋白共有19个磷酸化位点，其中9个Ser位点，分别位于第10、14、70、85、104、112、164、437、491个氨基酸；5个Thr位点，分别位于第97、115、273、292、351个氨基酸；5个Tyr位点，分别位于第4、221、256、392、453个氨基酸。推测2个CAT蛋白均是以Ser为主，Thr、Tyr为辅的方式。

与Ej-CAT1蛋白的相比，Ej-CAT2蛋白少了3个磷酸化位点，分别为第347氨基酸处的Ser位点，第414氨基酸处的Thr位点与第348氨基酸处的Tyr位点。

2.3.4 蛋白质功能位点预测 用ScaanProsite在线分析枇杷Ej-CAT1蛋白、Ej-CAT2蛋白的功能位点，结果显示：Ej-CAT1蛋白含有18个功能位点，其中3个N端糖基化位点，蛋白激酶C磷酸化位点4个，酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点有5个，酪氨酸磷酸化位点1个（386-392aa），N端豆蔻酰位点4个，酰胺化位点1个（414-417aa）。1个Catalase proximal heme-ligand singnature，1个Catalase proximal active site singnature。Ej-CAT2蛋白含有17个功能位点，其中3个N端糖基化位点，4个蛋白激酶C磷酸化位点，4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，1个酪氨酸磷酸化位点，4个N端豆蔻酰位点，1个酰胺化位点。1个Catalase proximal heme-ligand singnature，1个Catalase proximal active site singnature。

与枇杷Ej-CAT1蛋白功能位点相比，Ej-CAT2蛋白少了1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（347-350 aa），Ej-CAT2蛋白386-392 aa处酪氨酸磷酸化位点为Rde.Evd.Y，332-337 aa处N-豆蔻酰化位点为GvyySN，与Ej-CAT1蛋白有所不同。

2.3.5 蛋白质亚细胞定位预测 用PSORT对Ej-CAT1、Ej-CAT2蛋白亚细胞定位进行预测，发现2个CAT蛋白定位于过氧化物酶体的可能性较大，分值为0.748；其次是线粒体基质，分值为0.100。而Ej-CAT1、Ej-CAT2 蛋白信号肽及跨膜结构预测表明，2个蛋白均是非分泌蛋白，不含跨膜结构，是非跨膜蛋白。

2.3.6 蛋白质结构预测 PSIPRED软件预测表明Ej-CAT1、Ej-CAT2蛋白的二级结构是由α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲3种结构组成，其中无规则卷曲所占的比例较大，α-螺旋、β-折叠所占比例相当。枇杷CAT两个蛋白的二级结构并没有显著差异，只有两个细微差异。Ej-CAT2蛋白在氨基酸349-355处、475处形成α-螺旋，而Ej-CAT1蛋白则没有形成α-螺旋。GOR4软件预测结果与PSIPRED预测结果类似，Ej-CAT1二级结构中无规则卷曲占59.55%，α-螺旋占18.50%，β-折叠占21.95%；枇杷Ej-CAT2二级结构中无规则卷曲占59.76%，α-螺旋占16.46%，β-折叠占23.78%。

利用SWISS-MODEL工具对Ej-CAT1、Ej-CAT2蛋白的三级结构进行在线预测，预测结果如图4所示。两个CAT蛋白的三级结构基本相似，主要是由无规则卷曲，α-螺旋，β-折叠组成。

2.3.7 蛋白质系统进化树的构建 经NCBI BLASTn比对后，发现2个枇杷CAT氨基酸与碧桃（Prunus persica）、枣（Ziziphus jujuba）、毛果杨（Populus trichocarpa）、葡萄（Vitis vinifera）、甜樱桃（Prunus avium）、贯叶金丝桃（Hypericum performatum）、陆地棉（Gossypium hirsutum）、胡麻（Sesamum indicum）、烟草（Nicotiana benthamiana）、荷花（Nelumbo nucifera）、木榄（Bruguiera gymnorhiza）、冰叶日中花（Mesem-bryanthemum crystallinum）、甜椒（Capsicum annuum）、木薯（Manihot esculenta）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、马蹄莲（Zantedeschia aethiopica）、萝卜（Raphanus sativus）、芸薹（Brassica juncea）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）的相似性分别均在80%以上。将枇杷两个CAT成员与这22个氨基酸进行分子进化树的构建，结果见图5。从图5可见，整个进化树分成2个组群，水稻属于小组群，Ej-CAT1、Ej-CAT2与其余的植物均属于大组群。Ej-CAT1、Ej-CAT2与葡萄、碧桃、甜樱桃、木薯、小麦同处一小分支，有着很近的进化关系；与甜椒、荷花、马蹄莲、玉米有着相对较远的进化关系，与水稻cat-c的进化距离最远；与其他植物有着相对较近的进化关系。

2.4 枇杷试管苗离体保存过程中CAT基因的相对定量表达分析

由Real Time PCR反应得到的CAT及内参基因Actin基因的溶解曲线，均只出现1个单峰。从扩增曲线图上看，两个基因的曲线拐点清楚，指数期明显，整体平行性较好，表明CAT及Actin基因的引物特异性较好。制作的标准曲线结果显示，枇杷CAT和内参基因Actin的标准曲线线性范围较广，起始模板稀释倍数相关系数与Cq值良好。CAT及Actin标准曲线的扩增效率分别为1.933、1.958，标准曲线的斜率均在-3.4～-3.6 之间。综上，这两个基因的引物特异性良好，符合试验要求，可进行下一步试验。

6个不同时期材料进行qPCR，得到所有Ct值，计算各时期的相对表达量，结果见图6。CAT基因在6个不同保存时期都有表达，表达量的整体趋势呈字母“W”形状。保存1个月时，表达量最高；到保存4个月时，表达量急剧下降，其表达量仅是保存1个月时表达量的1/3；保存5个月时表达量稍微升高，到保存7个月时表达量又开始下降；保存9个月时，该基因表达量迅速上升，其表达量是保存7个月表达量的2倍；而保存9个月、11个月的表达量没有明显变化，表达相对稳定。

3 讨论与结论

3.1 枇杷CAT蛋白功能多样性

枇杷叶片两个CAT成员的氨基酸序列与多种植物的CAT蛋白氨基酸序列的相似性均在80%以上。在CAT氨基酸进化树分析中，枇杷不同CAT蛋白与葡萄、碧桃、甜樱桃、木薯、聚类在一起，与水稻cat-c的进化距离最远。根据生物学信息分析结果，枇杷叶片不同CAT成员均不含跨膜结构，不含信号肽，没有卷曲螺旋结构，是不稳定的亲水蛋白。亚细胞定位于过氧化物酶体，能与SOD、POD组成活性氧防御系统，参与活性氧代谢过程，催化H2O2分解为H2O和O2，能控制细胞内的氧化还原平衡，在枇杷试管苗离体保存中的植物防御、延缓衰老等方面起着重要作用。潜在磷酸化预测结果显示，CAT1蛋白具有22个磷酸化位点，CAT2蛋白有19个磷酸化位点，2个CAT成员均是以丝氨酸为主，酪氨酸、苏氨酸为辅的方式，调控枇杷试管苗离体保存中的信号转导及基因表达等活动。蛋白质功能的预测结果显示：CAT1和CAT2分别有18、17个功能位点，其中分别具有3个N-糖基化位点，4个蛋白激酶C磷酸化位点，4个N-豆蔻酰位点，1个酰胺化位点，5或4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，CAT1蛋白比CAT2蛋白多了1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。这些均说明了枇杷CAT含有多种蛋白质翻译后修饰方式[36]，其在枇杷体内拥有不同的功能作用。

枇杷2个CAT成员的氨基酸序列具有97.36%的相似性，拥有部分相似的功能和结构，但2个CAT蛋白还存在不同的结构与功能，因此，枇杷CAT两个成员可能在枇杷试管苗离体保存中相互协调、各自分工的方式来发挥作用。

3.2 枇杷CAT基因在试管苗离体保存中的作用

CAT对H2O2具有亲和力，能够在各种胁迫下清除多余的H2O2，防止形成羟自由基。CAT是多基因家族，其表达受到发育和环境等因素影响[33]，且不同基因成员的表达具有时空差异。程华等[16]认为银杏CAT基因的表达受到ABA、渗透压及温度等环境因素的影响。

枇杷试管苗离体保存过程中，各个时期CAT基因的表达量不同，在培养基中加入植物生长抑制剂PP333，保存1个月时CAT基因表达量最高，之后保存4个月、5个月及7个月的表达量均有所回落，在保存9个月和11个月时表达量又上升到一定水平。高表达量的CAT能够有效减少试管苗体内的活性氧积累，维持植物的生理代谢，能够延缓衰老。试管苗保存1个月时，枇杷试管苗叶片慢慢发育成熟，此时会有大量的活性氧产生，高表达CAT能够减少活性氧积累，降低氧化伤害。在之后的几个月，CAT基因的表达量减少，可能跟试管苗侧芽抽出新的嫩叶有关。到保存9个月、11个月时，CAT基因表达量维持在一定程度，可能是试管苗大部分枝叶进入成熟和衰老阶段，培养基中PP333也能够有效的控制植物的衰老，一大部分减少了植物体内一些活性氧的积累。枇杷CAT基因在整个离体保存中表达量不断变化，推测其在试管苗离体保存中起着重要的作用。

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