曾庆才等

摘 要 以微生物发酵床养猪技术带来的新兴农业副产物——微生物发酵床养猪垫料为主要培养基质，以产孢量为指标，通过单因素，响应面分析法优化生防菌哈茨木霉FJAT-9040固体发酵的培养基。单因素结果表明：发酵培养基主成份微生物发酵床养猪垫料与麸皮的比例为9 ∶ 1；最适疏松值、无机碳源和无机氮源分别为麦粒40.00%、蔗糖3.00%和硫酸铵2.00%。响应面分析结果表明，麦粒、蔗糖、硫酸铵对哈茨木霉产孢量存在显著相关性（p<0.05）。通过求解回归方程可得：当微生物发酵床养猪垫料 ∶ 麸皮=9 ∶ 1、麦粒含量36.74%、蔗糖含量3.07%、硫酸铵含量1.75%时，孢子产量最高，可达2.98×109个/g，与实际值相近。

关键词 哈茨木霉；固体发酵；培养基优化

中图分类号 S763.15 文献标识码 A

Optimization of Solid-state Fermentation Culture Medium Consisted

of the Microbial Fermentation Bed for the Biocontrol

Strain of Trichoderma harzianum FJAT-9040

by Response Surface Methodology

ZENG Qingcai1，2， XIAO Rongfeng2， LIU Bo2 *， HU Guiping2， CHEN Yanping2

1 College of Biological Science and Technology， Fuzhou University， Fuzhou， Fujian 350108， China

2 Agricultural Bioresource Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China

Abstract The optimization of solid-state fermentation culture medium for a biocontrol strain Trichoderma harzianum FJAT-9040 was studied using single factor analysis and response surface methodology（RSM）. The medium mainly contained pig litter， which was produced from microbial fermentation bed for raising pigs， and the sporulation yield was used as the indicator in all tests. The results of single factor tests showed that the ratio of pig litter and wheat bran， the content of wheat grain， carbon and nitrogen were 9 ∶ 1， 40.00% of wheat grain， 3.00% of sucrose， and 2.00% of ammonium sulfate， respectively. The results showed that wheat grain， sucrose and ammonium sulfate were significant for the spore of T. harzianum based on the response surface methodology analysis（p<0.05）. The optimal medium constitutes were as followed： 9 ∶ 1 of pig litter and wheat bran， wheat grain 36.74%， sucrose 3.07%， ammonium sulfate 1.75%， and the average yield of spore reached to 2.98×109 cfu/g， which was close to the actual fermentation.

Key words Trichoderma harzianum； Solid-state fermentation； Medium optimization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.026

木霉菌（Trichoderm. spp），广泛分布于土壤中，其生命力强，适应性广，对许多植物病原真菌有拮抗作用[1]。据不完全统计，已对18个属29种植物病原真菌具有拮抗作用[2]。因此，木霉菌作为一类具有重要生防价值的生防菌而倍受关注[3]。目前已有大量这类木霉菌的报道，如哈茨木霉（T. harzianum）、绿色木霉（T. viride）、钩状木霉（T. hamatum）、康宁木霉（T. koninngii）等[4]。其中哈茨木霉的研究与应用报道居多，李良等[5]利用哈茨木霉进行茉莉白绢病的防治，防治效果显著，可达90%以上。李琼芳等[6]将哈茨木霉T23、T158的孢子菌剂用于麦冬等根腐病的防治，防治效果较好，且优于化学农药多菌灵粉。其它研究结果表明，其对黄瓜枯萎病[Erwinia amylovora var.tracheiphila（Smith）Dye]、小麦纹枯病（Rhizotonia cerealis van der Hoeven apud. Boerema & Verhoeven）、番茄灰霉病（Botrytis cinerea）等病原真菌也有抑制作用[7-9]；对黄瓜、花生和茄子等多种作物有促进生长作用[10-12]；可诱导水稻产生抗病性[13]等。目前已有商品化的生防菌剂，如美国的哈茨木霉T-22，Topshield和以色列的哈茨木霉T-39，Trichodex等[14]。

在防治和生产中，木霉菌防治效果与其发酵生产关系紧密。目前，木霉的防治多采用孢子菌剂，虽然不少学者对其代谢产物在生防作用上进行了研究[15-17]，但由于代谢产物的结构复杂，样品处理难度大，生产成本高，最终限制其在工业上的应用。在生产实践中通过发酵方式（液体发酵或固体发酵）可以提高孢子数量。但是液体发酵所需设备相对复杂，且存在发酵产物浓度不高，生产成本高等问题[18]，而固体发酵具有培养基来源丰富，价格低廉，操作简单，孢子质量好等一系列优势，被公认为是获得真菌孢子的最好方法之一[19]。固体发酵的培养基可以是稻草、麸皮、秸杆等农业副产物。近年来兴起的微生物发酵床养猪技术带来了新的农业副产物——微生物发酵床养猪垫料，其含有丰富的养料，它是通过微生物将谷壳，锯末等发酵床原料及猪粪、尿等混合物中的有机物质进行分解发酵而成[20]。若将其作为固体发酵的培养基，能为菌株提供丰富的营养物质，不但可以获得大量的生防因子，还可以处理一些农业副产物，提高资源的利用价值，实现可持续发展。微生物发酵培养基的优化方法很多，如单因素实验法、正交设计试验法、响应面优化设计法等[21]，其中响应面优化设计以试验次数少，周期短等优势受到广泛应用[22]。响应面分析法是通过合理的实验设计，获得一定数据来拟合一个响应面，从而摸拟出真实的极限条件下的曲面，并进行可靠性地分析[23]。响应面分析法可以对一次项、二次项及其交互项对响应值的影响进行分析，通过之间的关系在响应面上获得最佳点，在试验设计与试验分析上具有更多优势[23]。本研究以微生物发酵床养猪垫料作为哈茨木霉FJAT-9040固体发酵的主要培养基原料，通过单因素实验与响应面法优化该菌固体发酵培养基配方，筛选出最适产孢的培养基配方，旨在进一步提高产孢量和农业副产物的利用率，为哈茨木霉的生物菌肥和制剂的工业化生产提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种 哈茨木霉FJAT-9040，福建省农业科学院农业生物资源所微生物菌种保存中心保存。在PD培养基中，28 ℃，170 r/min，培养4 d，无菌滤网过滤除去菌丝，制成孢子液，并稀释至1.00×107个/mL，备用。

1.1.2 培养基 PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 L，琼脂17～20 g，pH自然。PD为不加琼脂液体培养基。马铃薯购于福建永辉超市；葡萄糖来源于国药集团化学试剂有限公司；琼脂购于北京奥博星生物技术有限责任公司。

固体发酵培养基：微生物发酵床养猪副产物——发酵一年微生物发酵床养猪垫料（主要成分为谷壳，锯末）、麸皮、麦粒、碳源、氮源、自来水等按适合比例混合。微生物发酵床养猪垫料来源于厦门某部队后勤猪场；麸皮、麦粒来源于福州仓山；硝酸钠来源于国药集团化学试剂有限公司；蔗糖、乳糖、硫酸铵来源于天津市福晨化学试剂厂；硝酸铵来源于上海品杰化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 单因素优化设计 以产孢量为指标，采用单因子法筛选菌株固体发酵培养基的主要成份配比、麦粒、碳源和氮源，确定最适因子。

（1）固体发酵培养基主要成份微生物发酵床养猪垫料与麸皮配比的筛选。主要成份微生物发酵床养猪垫料与麸皮按体积比为10 ∶ 0，9 ∶ 1，8 ∶ 2，7 ∶ 3，

6 ∶ 4，5 ∶ 5，0 ∶ 10等配制7种培养基，每处理重复3次。每200.00 mL培养瓶中装入50.00 mL培养基，初始含水量40.00%，灭菌后，接入哈茨木霉FJAT-9040孢子液，28 ℃恒温发酵5 d。取5.00 g固体发酵物于45.00 mL无菌水中，搅拌均匀，稀释至适当倍数，吸取100 μL，均匀涂布于含300 μg/mL链霉素的PDA平板上，28 ℃恒温培养2 d，记录平板上萌发的孢子数。每克孢子数=同一稀释度平均孢子数×10×稀释倍数/5。筛选出最佳的主要成份配方比例。

（2）培养基中麦粒含量对哈茨木霉FJAT-9040产孢量的影响。往（1）中筛选出的培养基中添加浸泡过夜的麦粒，按体积比为10.00%、20.00%、30.00%、40.00%、50.00%进行添加，每处理重复3次。以下处理方法同（1）。筛选出最佳的疏松值（麦粒）含量。

（3）培养基中无机碳源对哈茨木霉FJAT-9040产孢量的影响。往（1）中筛选出的培养基中分别添加葡萄糖、蔗糖、乳糖，每处理重复3次。以下处理方法同（1）。筛选出最佳的无机碳源及最适浓度。

（4）培养基中无机氮源对哈茨木霉FJAT-9040产孢量的影响。往（1）中筛选出的培养基中添加硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠，每处理重复3次。以下处理方法同（1）。筛选出最佳的无机氮源及最适浓度。

1.2.2 响应面优化设计 在单因素筛选实验的基础上，根据Box-Benhnken设计原理，采用软件Design-expert 8.0进行3因素3水平的响应面分析实验，以孢子数为响应量，确定各因素对菌株产孢量影响的显著性和各组分的最佳组合。以响应因子Y为产孢量，麦粒（x1）、蔗糖（x2）和硫酸铵（x3）为3因素，因素3水平分别为：-1、0和1。实验设计具体见表1。

1.2.3 数据处理及验证实验 数据分析通过EXCEL处理，统计学分析通过DPS软件处理，响应面分析法利用Design-expert 8.0软件采用Box-Benhnken设计方法，对培养基成分进行3因素3水平优化。根据响应面预测的最佳培养基配方，按照1.2.1中（1）的方法操作，测定菌株的产孢量，以验证响应面预测的准确性。

2 结果与分析

2.1 培养基的单因子优化

2.1.1 固体发酵培养基主要成份微生物发酵床养猪垫料与麸皮配比的筛选 不同配比的微生物发酵床养猪垫料与麸皮对菌株产孢量的影响见图1。图1表明：菌株接种到不同比例的垫料与麸皮中，其产孢量差异很大，在全垫料培养基中的孢子数含量为1.80×106个/g；而在全麸皮培养基中的孢子含量仅为3.00×105个/g，数量最少。当垫料 ∶ 麸皮=9 ∶ 1时，产孢量最大，达到4.60×106个/g；当垫料 ∶ 麸皮=8 ∶ 2时，产孢量次之，达4.20×106个/g。当垫料 ∶ 麸皮=9 ∶ 1或8 ∶ 2时，发酵效果较好，且9 ∶ 1时产孢量最高。因此，选择该比例为菌株固体发酵培养基主要成份的最佳配比。

2.1.2 培养基中麦粒含量对哈茨木霉FJAT-9040产孢量的影响 菌株在不同麦粒含量的培养基中产孢情况见图2。从图2可见，在一定体积范围内，随着麦粒含量的增加，哈茨木霉产孢量升高。当麦粒添加量在10.00%～30.00%时，菌株产孢量均在1.00×106个/g以上；当添加40.00%体积的麦粒时，产孢量最大，达到2.33×107个/g，远高于对照组的产孢量，3.33×106个/g；当添加50.00%体积的麦粒时，产孢量有所减少，为1.13×107个/g。

2.1.3 培养基中无机碳源对哈茨木霉FJAT-9040产孢量的影响 菌株在不同碳源下的产孢情况见图3。由图3可知，不同种类的无机碳源对产孢量有一定的影响。当添加无机碳源为蔗糖时，产孢量最大，达到6.67×107个/g，其后依次为乳糖，葡萄糖。随着蔗糖含量的增加，菌株的产孢量先增加后减少（图4）。当添加浓度为3.00%时，产孢量最大，达到3.37×108个/g。

2.1.4 培养基中无机氮源对哈茨木霉FJAT-9040产孢量的影响 菌株在不同氮源下的产孢情况见图5。当添加无机氮源为硫酸铵时，产孢能力最强，产孢量最大，达到1.47×109个/g。而硝酸铵和硝酸钠对菌株的产孢并无明显差异，其产孢量一致，均为1.00×109个/g。在添加硫酸铵范围内，随着添加量的增加，菌株产孢量先增加后下降（图6）。当添加1.00%或2.00%时，发酵效果较好，且2.00%时，产孢量最高。

2.2 固体培养基重要营养成分含量响应面优化

2.2.1 响应面法优化实验 根据单因素实验结果，以微生物发酵床养猪垫料为基础，麦粒含量为30.00%～50.00%（V/V），蔗糖浓度为2.00%～4.00%，硫酸铵浓度为1.00%～3.00%，进行响应面优化实验设计，结果见表2。

2.2.2 二次响应面回归模型的建立及方差分析

经优化后培养基组成为麦粒含量36.74%，蔗糖含量3.07%，硫酸铵含量1.75%，在发酵温度28 ℃，接种量5%，含水量40%的条件下发酵5 d，孢子产量可达2.80×109个/g。陈欣等[33]通过中心组合实验设计得到盾壳霉（Coniothyrium minitans）产孢的最优培养基组合，且在此组合下每克麸皮产孢量可达1.04×1010个/g。本研究组合以微生物发酵床养猪垫料为主，为微生物发酵床养猪垫料的运用提供了一条新出路，避免了随意丢弃造成的环境污染及资源浪费，实现资源地循环利用，同时该组合实验效果与孙斐[24]、刘时轮[27]、王永东[29]等人的研究结果相近，说明该组合可为含哈茨木霉的生物肥料和生物制剂生产提供理论指导。

参考文献

[1] 张爱萍. 木霉生防作用研究进展[J]. 绿色植保， 2009（3）： 36.

[2] 陈 捷， 朱洁伟， 张 婷， 等. 木霉菌生物防治作用机理与应用研究进展[J]. 中国生物防治学报， 2011， 27（2）： 145-151.

[3] 庄敬华， 陈 捷， 杨长成， 等. 生防木霉菌生物安全性评价[J]. 中国农业科学， 2006， 39（4）： 715-720.

[4] 彭可为， 李 婵. 木霉菌的生物防治研究进展[J]. 安徽农业科学， 2010， 38（2）： 780-782.

[5] 李 良， 申功进， 邵志和. 哈茨木霉对茉莉白绢病的生物防治的研究[J]. 浙江农业大学学报， 1983， 9（3）： 221-225.

[6] 李琼芳， 曾华兰， 叶鹏盛， 等. 哈茨木霉（Trichoderma harzianum）T23生防菌筛选及防治中药材根腐病的研究[J]. 西南大学学报： 自然科学版， 2007， 29（11）： 119-122.

[7] Bhuyan S A. Antagonistic effective of Trichoderma viride， T. Harzianum and Asperigillus terreus on Rhizoctonia solani causing sheath blight of rice[J]. Journal of the Agricultural Science Society of North East India， 1994， 7（1）： 125-127.

[8] 刘爱荣， 陈双臣， 陈 凯， 等. 哈茨木霉对黄瓜尖孢镰刀菌的抑制作用和抗性相关基因表达[J]. 植物保护学报， 2010， 37（3）： 249-254.

[9] 管怀骥， 陈 莉. 哈茨木霉TH-1菌株对小麦纹枯病的控制效果研究[J]. 安徽农业科学， 2011， 39（16）： 9 664-9 665.

[10] 姚 彬， 王傲雪， 李景富. 哈茨木霉对4种番茄病原真菌抑制作用的研究[J]. 东北农业大学学报， 2009， 40（5）： 26-31.

[11] 杨春林， 席亚东， 刘波微， 等. 哈茨木霉T-h-30对几种蔬菜的促生作用及病害防治初探[J]. 西南农业学报， 2008， 21（6）： 1 603-1 607.

[12] 王献慧， 梁怀志， 魏 林. 哈茨木霉T2-16菌剂不同使用方法对花生防病促生长效果的研究[J]. 花生学报， 2012， 41（2）： 24-27.

[13] 胡 洁， 秦克伟， 蔡 枫， 等. 哈茨木霉SQR-T037对茄子幼苗促生效应的研究[J]. 安徽农业科学， 2012， 40（32）： 15 671-15 673， 15 694.

[14] 李 杰， 王景胜， 肖连冬， 等. 绿色木霉-M1固态发酵产纤维素酶条件研究[J]. 现代农业科技， 2011， 12： 49-51.

[15] 王红梅， 蒋立科， 陶 芳， 等. 哈茨木霉高产几丁质酶菌株的筛选及产酶条件研究[J]. 浙江大学学报（农业与生命科学版）， 2010， 36（2）： 146-152.

[16] 郭培磊， 刘 限， 高增贵， 等. 木霉菌胞外酶及对番茄灰霉病菌作用的研究[J]. 北方园艺， 2009（8）： 126-128.

[17] Nzojiyobiri jean Berchmans， 徐 同， 宋凤鸣， 等. 哈茨木霉NF9菌株对水稻的诱导抗病性[J]. 中国生物防治， 2003， 19（3）： 111-114.

[18] 葛 龙， 赵 艳， 章亭洲. 固态发酵技术的特点与应用[J]. 饲料与畜牧， 2010（8）： 54-56.

[19] 敖新宇， 程立君， 陈玉惠. 生防木霉SS003菌株（Trichoderma atroviride）的固体发酵工艺研究[J]. 江西农业大学学报， 2012， 34（6）： 1256-1261.

[20] 蓝江林， 刘 波， 陈 峥， 等. 微生物发酵床猪舍环境气味电子鼻判别模型的研究[J]. 福建农业学报， 2012， 27（1）： 77-86.

[21] 肖怀秋， 李玉珍. 微生物培养基优化方法研究进展[J]. 酿酒科技， 2010（1）： 90-94.

[22] 郝学财， 余晓斌， 刘志钰， 等. 响应面方法在优化微生物培养基中的应用[J]. 食品研究与开发， 2006， 127（1）： 38-40.

[23] 张秀霞， 吴佳东， 滕 芝， 等. 响应面法优化固定化微生物降解石油污染物[J]. 石油学报， 2012， 28（5）： 877-882.

[24] 孙 斐， 陈靠山， 张鹏英， 等. 固态发酵麸皮和玉米芯生产拟康氏木霉孢子的研究[J]. 中国农学通报， 2010， 26（6）： 236-239.

[25] 夏斯琴， 王 伟. 绿色木霉T4的固体发酵工艺及其制剂稳定性的研究[J]. 化学与生物工程， 2008， 25（12）： 52-56.

[26] 刘时轮， 李 勇， 傅俊范， 等. 绿色木霉菌株Tv04-2固体发酵条件研究[J]. 华北农学报， 2008， 23： 244-247.

[27] 赵永强. 木霉菌对大豆根腐病菌的生防机制及其制剂的初步研究[D]. 大庆： 黑龙江八一农垦大学， 2010.

[28] 茹水江. 木霉颗粒剂ST-6的研制及其应用研究[D]. 杭州： 浙江大学， 2010.

[29] 王永东， 蒋立科， 岳永德， 等. 生防菌株哈茨木霉H-13固体发酵条件的研究[J]. 浙江大学学报（农业与生命科学版）， 2006， 32（6）： 645- 650.

[30] Ambat P， Ayyanna C. Optimizing medium constituents and fermentation conditions for citric acid production from palmyra jaggery using response surface methods[J]. Journal of Microbiology & Biotechnology， 2001， 17： 331-335.

[31] Ratnam B V V， Naras imha Rao M， Dmodar Rao M， et al. Optimization of fermentation conditions for the production of ethanol from sago starch using response surface methodology[J]. Journal of Microbiology & Biotechnology， 2003， 19： 523-526.

[32] Trupkin S， Levin S， Forchiassin F， et al. Optimization of a culture medium for ligninolytic enzyme production and synthetic dye decolorization using response surface methodology[J]. Journal of Industrial Microbiology Biotechnology， 2003， 30： 682-690.

[33] 陈 欣， 李 寅， 堵国成， 等. 应用响应面方法优化Coniothyrium minitans固态发酵生产生物农药[J]. 工业微生物， 2004， 34（1）： 26-29.