朱楠等

摘 要 采用卡宝品红染色压片法对黄花烟草（Nicotiana rustica）、栽培烟草（Nicotiana tabacum L. Var. K326）和残波烟草（Nicotiana repanda）的小孢子发生发育过程进行研究。结果表明：黄花烟草、栽培烟草K326及残波烟草小孢子发生和发育过程的胞质分裂皆为同时型，四分体有十字交叉型、正四面体型和左右对称型3种构型，成熟花粉粒为2细胞型。3种烟草小孢子发生发育过程基本正常，但不同程度地出现了减数分裂异常现象，如同一花药内小孢子发育不同步以及同一细胞内染色体步调不一致、染色体桥、染色体落后、微核等。

关键词 烟草；小孢子；雄配子体；减数分裂

中图分类号 S572 文献标识码 A

Microsporogenesis and Male Gametophytic Development

of Three Species of Nicotiana

ZHU Nan1， LIAO Jugou1， SONG Biqing2， SUO Wenlong2

YAO Heng3， CHEN Suiyun1 *， MA Wenguang3 *

1 School of Life Science， Yunnan University， Kunming， Yunnan 650091， China

2 Yuxi Zhongyan Tobacco Seed Co.， Ldt.， Yuxi， Yunnan 653100， China

3 Tobacco Research Institute， Yuxi， Yunnan 653100， China

Abstract The microsporogenesis and development of male gametophyte of Nicotiana rustica， Nicotiana tabacum L. Var. K326 and Nicotiana repanda were observed via light microscopy after staining with carbolfuchs. Results showed that ： meiosis in microspore was simultaneous cytokinesis in the development of male gametophyte of Nicotiana tabacum L. Var. K326， Nicotiana rustica and Nicotiana repanda. Cytokinesis at meiosis of microspore mother cells was simultaneous and tetrads were mostly decussate， tetrahedral and isobilateral. The mature pollens belong to 2 cells type. Microsporogenesis and development of male gametophyte of different tobacco are in common with those of others. However， the phases of meiosis of microspore mother cells in some cultivars developed abnormally in the same microsporangium to some extent. The chromosomes were out of step in the same cell， with laggard chromosomes， chromosome bridges or micronucleus.

Key words Nicotiana； Microsporogenesis； Male gametophyte； Meiosis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.004

烟草隶属双子叶植物纲（Dicotyledoneae），茄科（Solanaceae），烟草属（Nicotiana）[1]。烟草属包括3个亚属：黄花烟亚属（Rustica）、普通烟亚属（Tabacum）和碧冬烟亚属（Petuuioides），共计66个种。黄花烟草为黄花烟草亚属（Rustica）黄花烟草组（Rusticae）中仅有的1个种，原产于南美洲，是我国栽培利用的重要烟草种之一[2]。普通烟亚属中的栽培品种K326（Nicotiana tabacum L. Var. K326）是广泛种植的烤烟品种[3]，栽培烟草遗传基础狭窄，对许多病虫害不具抗性[4]。N. repanda W.属于碧冬烟亚属，对多种病虫害等具有高抗性，是栽培烟草改良的天然基因库[5]。目前对烟草的研究主要集中在抗病性[6]、栽培模式[7]、环境调控技术[8]、基因组学[9]等方面。烟草大小孢子的发生发育过程直接影响该物种的生殖和繁衍，决定着烟草种质资源的保持和开发利用。康红梅[10]等研究了烟草大孢子发生发育过程，但针对烟草小孢子发育相关的研究报道较少。本研究通过对3种不同烟草的小孢子发生发育过程进行观察比较，以期为烟草的系统分类、遗传育种、种质资源优化等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为种植于昆明市官渡区试验田的黄花烟草、栽培烟草K326、残波烟草。材料于2011年8月移栽，花期为2011年9月至2011年11月。在现蕾期分别采集各种烟草生长直径短于0.5 cm的花蕾各30朵，放入Carnoy固定液（无水酒精 ∶ 冰乙酸=3 ∶ 1）固定24 h后，转移到70%的酒精中保存备用。

1.2 方法

将准备好的材料转入45%的冰乙酸中软化20 min，按花蕾的大小不同分类，由小到大取出花药，分别置于干净的载玻片中央，滴加少量卡宝品红，用镊子挤压出花粉粒，盖上盖玻片，压片，置于Olympus显微镜下观察及拍照[11]。

2 结果与分析

3种烟草花均为两性花，每朵花5个花药，每个花药具4个花粉囊。在花蕾早期，花粉囊内表皮下的孢原细胞首先进行1次平周分裂，形成两层细胞，即外层的初生壁细胞和内层的造孢细胞。初生壁细胞进行平周分裂形成内外两层次生壁细胞，连同外面的表皮共3层细胞。同时造孢细胞也不断分裂分化而形成次生造孢组织。次生造孢细胞排列紧密、体积大、胞质浓厚、核仁大而显著， 由其进行不断的分裂分化而发育形成小孢子母细胞。小孢子母细胞周围开始沉积胼胝质，最终形成一层胼胝质壁，随着胼胝质壁不断增厚，它由不规则的形状变成圆形，随后彼此分离开始进入减数分裂期。减数分裂前核内出现一团明显的细丝状染色质，并与核仁连在一起处于核的一侧，可作为减数分裂起始的标志。黄花烟草小孢子的减数分裂与其他两个烟草种基本相似，在此以黄花烟草减数分裂和小孢子发育过程为例阐述三者之间的共性。

2.1 黄花烟草小孢子减数分裂过程

减数第一次分裂前细线期（图版Ι-1），此时细胞核腔内充满了细长、线状的染色体，细胞核和核仁增大，随后细胞进入减数分裂前期中的细线期。紧接着细胞内的同源染色体两两配对，为偶线期（图版Ι-2）。染色体继续缩短变粗，即进入粗线期，在此期间，四分体中的姐妹染色单体之间发生了DNA片段的交换，导致其父本和母本之间遗传信息的互换，导致基因重组。随后细胞中发生交叉的染色单体开始分开，进入双线期（图版Ι-3）。染色单体分开后，染色体变成紧密凝集的状态向核四周靠近。核膜、核仁消失，纺锤体形成，进入终变期（图版Ι-4）。之后小孢子母细胞进入减数分裂中期I（图版Ι-6），该时期中各成对的同源染色体双双移向细胞中央的赤道板，着丝点依次成对排列在赤道板两侧。在纺锤体的牵引下，成对的同源染色体各自发生分离，分别移向两极，即后期（图版Ι-8）。到达两极的同源染色体又凝聚起来，核膜、核仁重新出现，细胞分裂进入末期（图版Ι-9），此时细胞质不分裂，形成一个双核细胞。这个双核细胞中每个细胞核染色体数目只有原来母细胞的一半。有双核的细胞紧接着发生第二次减数分裂，进入减数第二次分裂前期（图版Ι-10），细胞中两个核附近的染色体散乱分布，随后再次凝聚，核膜、核仁再次消失，纺锤体形成。接着染色体着丝点排列到细胞中央的赤道板上，即减数第二次分裂中期（图版Ι-12）。其染色体形态和减数分裂中期I大致相同，但不存在同源染色体。之后每条染色体着丝点分离，两条姐妹染色单体分开，成为两条染色体。它们在纺锤丝的牵引下移向细胞的两极，即后期（图版Ι-14），末期核膜、核仁重新出现，到达两极的染色体分别进入两个子细胞。

2.2 黄花烟草雄配子体发育过程

减数第二次分裂后，四核细胞最初被共同的胼胝质包围，随着细胞板的形成，四核细胞发生胞质分裂，小孢子四分体形成，在3种烟草中都观察到十字交叉型（图版Ι-16）、左右对称型（图版Ι-17）和正四面体型（图版Ι-18）的四分体，3种烟草小孢子四分体的3种排列形式的频率统计见表1。刚释放出来的小孢子细胞壁较薄、富含原生质、核居中、无萌发孔，即单核居中期（图版Ι-21）。随着小孢子的继续发育，由解体绒毡层供给其营养，小孢子细胞壁逐渐增厚，出现中央液泡，单核被液泡推向细胞边缘，出现3个萌发孔，即单核靠边期（图版Ι-22）。此时细胞原生质浓厚，细胞分裂更加旺盛，紧接着小孢子进行有丝分裂，形成一个较大的营养细胞和一个较小的生殖细胞，即二核靠边期（图版Ι-23）。其中营养细胞内富含淀粉、脂类等物质，为花粉管的萌发提供物质基础。即烟草的单核小孢子通过先进行1次正常的非均等分裂，然后通过营养细胞反复分裂的发育途径进行发育[12]。由于壁物质的不均等加厚，此时整个花粉粒外壁形成一个弓形隔壁，不久弓形壁消失，发育为成熟花粉粒（图版Ι-24），此时花粉内营养核和生殖细胞占据大部分体积，在后期花粉内将积累淀粉粒和脂肪。

2.3 烟草小孢子发生发育过程出现的异常现象

对3种烟草的小孢子发生发育过程观察结果表明：3种烟草小孢子发生发育过程基本正常，但少数细胞中出现了染色体桥、染色体滞后、不同步和微核等异常现象，不同种烟草出现异常类型和比率有差异。

2.3.1 染色体桥 染色体桥是由于正常的染色体同倒位染色体之间发生交叉互换，使配子染色体上某一区段缺失或重复，导致子代出现异常性状。对栽培烟草K326的小孢子发育过程观察后发现，少数细胞在其减数第一次分裂后期Ⅰ出现染色体桥（图版Ⅱ-9），出现染色体桥的细胞占有丝分裂细胞总数的0.05%（表2），黄花烟草和残波烟草小孢子发生发育过程未观察到染色体桥出现。

2.3.2 染色体滞后 染色体滞后是由于受外界环境的影响，少数染色体不能进一步分裂，在同一有丝分裂中期或后期以染色单体的形式表现出来。在对黄花烟草、栽培烟草、残波烟草3个烟草种小孢子减数第一次分裂中期（图版Ⅰ-7；图版Ⅱ-7；图版Ⅲ-8）和减数第二次分裂中期（图版Ⅰ-13；图版Ⅱ-14；图版Ⅲ-14）的观察中发现，3种烟草均出现个别染色体滞后的现象，3种所观察出现的概率统计分别为0.1%、0.05%、0.07%（表2）。

2.3.3 微核 微核（micronucleus，MCN）是出现在主核旁边体积通常小于主核1/3的小核，它是真核类生物细胞中染色体畸变形成的一种异常结构。在本实验中观察到在残波烟草小孢子发育四分体时期有微核的出现（图版Ⅲ-11、16），出现微核的细胞比率为0.08%（表2）。初步推测残波烟草微核的形成有两方面的原因：一可能是残波烟草小孢子在减数分裂时期，由于分裂间期产生的染色体断片在分裂过程中不能与正常染色体协同活动，在进入分裂期时，被排斥在主核周围形成不规则的染色质团（图版Ⅲ-5），占统计细胞比率为7%（表2）。有的染色体质团会被包埋在主核内（图版Ⅲ-4），所占细胞比率统计为：0.8%（表2）。随后发育成微核。二则可能是减数分裂过程中形成的滞后染色体在分裂末期形成微核。出现微核的细胞普遍出现细胞质着色浅、透光性较强，而且细胞核体积缩小，染色质染色较深，染色质呈现部分或者全部凝集。其他两个烟草品种有滞后染色体出现，却未发现有微核的形成，可能是所观察的细胞数量不足。

2.3.4 减数分裂节奏高度不同步 在对3种烟草小孢子压片观察后发现：小孢子发育不同步包括同一花药的不同花粉囊中发育时期不同以及同一花粉囊中不同小孢子分裂的进程也不一致（图版Ⅰ-25；图版Ⅱ-21；图版Ⅲ-21），一张制片上往往能观察到3～5个分裂相，在残波烟草的小孢子减数分裂过程中发现，同一视野中出现了减数第二次分裂间期的小孢子母细胞和已经发育成熟的花粉粒；小孢子发育不同步还包括同一细胞中染色体步调不一致，如在残波烟草减数第二次分裂中后期同一细胞中2组染色体步调不一致（图版Ⅲ-15）。

3 讨论

3.1 3种烟草小孢子发育的异同及其意义

本研究通过对3种烟草小孢子发生发育过程的观察发现：3种烟草小孢子的发生均从孢原细胞开始，经过造孢细胞、小孢子母细胞、四分体、小孢子和单核花粉粒等发育阶段，最后形成二核花粉。胞质分裂为同时型，小孢子四分体排列有十字交叉型、正四面体型和左右对称型，成熟的花粉粒包含一个较大的营养核和一个较小的生殖核。这与Sunderland[12]对芍药属、大麦属、烟草属和曼陀罗属等植物的观察并提出了二型花粉的假设基本一致。也符合Palmer C E[13]早在烟草花药培养中发现第1次分裂为不对称的观点。以上实验结论初步表明3种烟草具有较高的同源性。

3.2 小孢子母细胞减数分裂的异常与小孢子的育性

3种烟草小孢子发生发育过程类似且发育过程基本正常，少数细胞中出现了染色体桥、染色体滞后、微核和染色体不同步现象，但这些异常现象不影响3种烟草正常的生殖繁育过程。

栽培烟草K326的小孢子发育过程中观察到染色体桥，染色体桥在染色体移向两极进入子细胞时被拉断，断片不能进入子细胞的核内，在分裂的后期可能形成微核导致小孢子不育。残波烟草小孢子发育四分体时期少数细胞中有微核出现，这部分细胞通常有较密集的核固缩，无法进行正常的有丝分裂，导致细胞早期凋亡，形成不可育的配子。有研究表明生活污水中的有机物及各种毒害成分诱发蚕豆微核率显著增加[14]。推测残波烟草小孢子发生发育过程较其他两个种小孢子发育更易受外界环境条件影响。

3种烟草均在不同比率的细胞中观察到滞后染色体，滞后染色体成因可能是由于杂种起源的植物物种，根据两亲本的亲缘关系远近而表现出不同的异质性，引起染色体间同源性表现差异，导致减数分裂过程表现出异常[15]；另外，外界环境的改变也会导致滞后染色体的产生，有研究表明在pH与Al的作用下，细胞会出现滞后染色体导致减数分裂畸变效应[16]。染色体落后会使所形成的二分体染色体数目不相等或不能形成正常的四分体，以致这部分烟草小孢子母细胞在早期或双核前期发生败育现象，这与杨弘远[17]认为双子叶植物小孢子败育大都偏早的观点一致。

3种烟草小孢子均出现减数分裂高度不同步现象，推断其原因可能是由于减数分裂进入前期Ι、中期Ι时，花粉母细胞的初始细胞壁便完全消失，同时形成胼胝质壁使细胞间的联系消失，并且胼胝质壁的形成也不同步，结果每个小孢子母细胞在孤立的环境中进行减数分裂，细胞的个体差异得到充分体现。这是花药内部发育协调性差异的表现，是一种比较原始的特性[18]。这种特性可以延长花期，增加两性功能相互作用的时间，对于其物种的繁衍具有重要的意义[15]，但也可能导致小孢子发育异常。

针对小孢子雄核发生发育的细胞生物学研究对烟草生殖生物和遗传育种具有重要的指导意义，但今后还应该从生理学和遗传学等角度，考虑基因型[19]、绒毡层[20]、低温[21]等很多内外因素对小孢子发生发育的影响，以更全面科学的指导烟草的栽培育种实践。

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