杨冬平 高兆银 李敏等

摘 要 探讨水杨酸结合超声波处理对芒果采后炭疽病的抗病性及其相关防御酶活性的影响。以绿熟‘贵妃芒为试验材料，用水杨酸（2 mmol/L）、超声波（40 kHz，500 W）单独处理及两者结合处理，贮藏24 h后进行损伤接种芒果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），并在接种后第6天测定病原菌的致病性；同时，对处理后未接种果实，每2 d取样一次，测定果肉组织中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、几丁质酶（CHT）和β-1，3葡聚糖酶（GLU）等相关防御酶的活性和果皮中总酚含量的变化。结果表明：水杨酸能有效抑制芒果采后炭疽病病斑的扩展，能够提高相关防御酶的活性和果皮中总酚的积累；水杨酸结合超声波处理显著提高水杨酸单独处理的作用效果，显著增强了果实抗病性，是芒果采后炭疽病防控的新技术。

关键词 芒果；水杨酸；超声波；抗病性

中图分类号 Q945.8 文献标识码 A

芒果（Mangifera indica L.）属漆树科芒果属果树，是中国南方地区的一种重要经济作物，因其风味独特，肉质嫩滑且富含有机酸、维生素、抗氧化物质等多种营养成分而深受大众喜爱[1]。然而，芒果易受病原微生物侵染，从而引起果实贮运期间严重腐烂，造成极大的经济损失。炭疽病是导致芒果采后腐烂和品质劣变的主要病害之一，引起该病的主要病原菌为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）[2]。该菌具有潜伏侵染的特性，在田间较少引起果实发病，但在采后贮藏过程中逐渐出现症状[3]。采用噻菌灵、咪鲜胺等化学杀菌剂处理是控制芒果采后炭疽病的有效手段[4-5]。然而，使用杀菌剂所引起的药物残留、环境污染、病原菌产生抗药性及危害人体健康等问题日益凸现[6]。因而寻求安全高效的采后处理技术是芒果保鲜中需要亟待解决的问题。

水杨酸（Salicylic acid，SA），即邻羟基苯甲酸，是植物体内自身合成的一种简单酚类物质，也是植物组织中的一种天然活性物质，被认为是一种新型的植物内源激素和信号分子，参与调节生物及非生物逆境响应等诸多生理生化过程[7]。大量研究表明，在采前或采后使用适当浓度水杨酸处理能够诱导果实产生抗病性，可有效降低果实腐烂率和改善果实品质[7-8]。

超声波（Ultrasound，US），是由机械振动在媒质中的传播而产生的，频率一般在20 kHz以上，在液体介质中传播时的显著特点是会产生空化现象[9]，US的空化作用能在细胞壁与细胞液等非均相间产生微射流和局部高热、高压，使物体表面产生冲击和腐蚀，这对细菌、真菌等微生物有强烈的杀灭作用[10]。Cao等[11]研究发现，40 kHz US处理可有效抑制草莓果实采后病害的发生，并改善了果实的品质。然而，US单独处理香梨[12]、鸭梨[13]、桃[14]等果实的保鲜效果并不理想，这可能与病原菌在这些果实中的潜伏侵染位置较深有关。近年研究结果表明，US结合诱抗剂处理可显著改善保鲜效果。由于这些复合处理技术操作简便，成本低廉，在果蔬采后保鲜中具有广阔的应用前景。然而，US处理及SA结合US处理对芒果采后病害的控制作用目前尚未见报道。本研究以“贵妃”芒果果实为试验材料，探讨SA结合US处理对损伤接种C. gloeosporioides后病斑扩展的影响，以及SA结合US处理后果实体内的防御相关酶及总酚积累的变化规律，以期为芒果采后炭疽病综合防控提供理论依据和应用参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试芒果果实（M. indica cv. Guifei）购自三亚市崖城镇芒果园，芒果采摘后用塑料框装好，4 h内运回实验室。挑选大小一致、无机械损伤、无病虫害、成熟度一致的果实，用0.1 g/L次氯酸钠溶液浸泡2 min，以清水冲洗后在（25±1）°C相对湿度（RH）85%～95%条件下自然晾干，备用。

炭疽菌（C. gloeosporioides）分离自发病果实，于28 ℃培养纯化，4 ℃储藏备用。

1.2 方法

1.2.1 果实处理方法 将芒果果实随机分成4 组，每组40个，重复3次，按下述方法分别处理。（1）对照： 用清水浸泡10 min； （2）US处理： 将果实置于盛有8 L清水的超声波清洗仪中， 在40 kHz、 500 W条件下处理10 min； （3）SA处理： 将果实在2 mmol/L的SA溶液[含0.05% Tween 80（V/V）]中浸泡10 min； （4）SA+US处理： 将果实置于盛有8 L 2 mmol/L SA溶液的超声波清洗仪中，在40 kHz、500 W条件下处理10 min。将不同处理的果实各分为2组，一组用于刺伤接种，测定病斑大小；另一组用于测定相关防御酶活性及总酚含量。待果实自然晾干后，置于（25±1）°C、RH 85%～95%条件下贮藏。

1.2.2 损伤接种 各处理芒果果实在室温下放置24 h后，进行刺伤接种。（1）挑取在PDA中培养7 d的炭疽菌（C. gloeosporioides），用无菌水配成1.0×106 CFU/mL的孢子悬浮液；（2）用灭菌打孔器在果实赤道线刺孔1个（深3 mm，直径6 mm），将白色乳汁从孔中吸出后，注入20 μL孢子悬浮液；（3）将接种后的果实置于塑料保鲜盒中，并贮藏于（25±1）℃、RH 85%～95%条件中，6 d后对果实病斑扩展情况进行观察。每处理20个果实，重复3次。

1.2.3 取样方法 每2 d对未接种果实取样1次，果皮和果肉组织分别用液氮速冻，于-80 ℃中保存备用。每处理3个果实，重复3次。

1.2.4 果肉组织相关防御酶活性及果皮总酚含量的测定 （1）苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的测定：PAL活性的测定参照Assis等[15]的方法并作部分修改。取5 g冷冻果肉组织，放入研钵中，加入5 mL 100 mmol/L硼酸缓冲液（pH8.8）[含5 mmol/L β-巯基乙醇、2 mmol/L EDTA以及4%的PVP]，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4 ℃，12 000×g条件下离心30 min，上清液即为粗酶液。反应液为：0.3 mL粗酶液、2.7 mL硼酸缓冲液和0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸，以提取液为空白对照。反应液混匀后以40 ℃水浴60 min，立即加入0.2 mL 6 mol/L HCl终止反应，随后测定OD290值。以每分钟OD值变化0.001为一个酶活性单位（U），用U/（min·g FW）表示酶活性。

（2）过氧化物酶（POD）的测定：POD活性测定参考吴样孙等[16]的方法。取5 g冷冻果肉组织，放入研钵中，加入5 mL 100 mmol/L磷酸缓冲液（pH 6.0），在冰浴条件下研磨成匀浆；于4 ℃，12 000 ×g条件下离心30 min，取上清液作为粗酶液。反应液为：1 mL粗酶液、2 mL 50 mmol/L愈创木酚及0.2 mL 2% H2O2，提取液为空白对照，随后在28 ℃的条件下测定OD470值。以每分钟OD470值增加1表示一个酶活力单位（U），用U/（min·gFW）表示酶活性。

（3）几丁质酶（CHT）活性测定：CHT活性的测定参照曹建康等[17]的方法。取5 g冷冻果肉组织，放入研钵中，加入5 mL 100 mmol/L的醋酸缓冲液（pH5.2）[含1 mmol/L EDAT和5 mmol/L β-巯基乙醇]，在冰浴条件下研磨成匀浆；于4 ℃，12 000 ×g条件下离心30 min，取上清液于4 ℃透析过夜用作酶液。反应液为：1 mL酶液和0.5 mL 10 g/L胶状几丁质悬浮液，混匀后以37 ℃保温培养l h，加入0.1 mL 30 g/L的脱盐蜗牛酶，继续在37 ℃中保温培养1 h；取出后，立即加入0.2 mL 0.6 mol/L的四硼酸钾溶液后，在沸水浴中煮3 min，然后迅速冷却，加入2 mL用冰醋酸稀释5倍的对二甲氨基苯甲酸（DMAB）储备液，再次以37 ℃保温培养20 min后进行显色反应，以蒸馏水为空白对照，测定反应液OD585值。根据标准曲线求出样品液中的N-乙酰葡萄糖胺的量，以每秒钟每克芒果果实鲜重中酶分解胶状几丁质产生的1×10-9 mol N-乙酰葡萄糖胺作为一个CHT活性单位（U），用U/（s·g FW）表示酶活性。

（4）β-1，3葡聚糖酶（GLU）活性测定：GLU 活性的测定参照 Mauch 等[18]的方法。取5 g冷冻果肉组织，放入研钵中，加入5 mL 50 mmol/L醋酸缓冲液（pH 5.2）[含1 mmol/L EDTA、5 mmol/L β-巯基乙醇和5 mmol/L抗坏血酸]，在冰浴条件下研磨成匀浆；于4 ℃，12 000×g条件下离心30 min，将上清液于4 ℃透析过夜用作酶液。反应液为：0.2 mL酶液和0.1 mL昆布多糖（0.5%，W/V），以37 ℃保温40 min；加入1.7 mL无菌水稀释，再加1.5 mL 3，5-二硝基水杨酸煮沸5 min进行显色反应，用去离子水将溶液稀释至25 mL，以蒸馏水为空白对照，测定反应液OD540值，根据标准曲线求出样品液中的还原糖量。以每秒钟每克芒果果实鲜重中酶分解的昆布多糖产生的1×10-9 mol葡萄糖作为一个GLU活性单位（U），用U/（s·gFW）表示酶活性。

（5）总酚含量的测定：参照Pirie等[19]的方法。称0.5 g果皮组织，将其与预冷的5 mL 1% HCl-CH3OH溶液充分研磨进行提取，然后于4 ℃，12 000 ×g条件下离心20 min，测定上清液OD280值。总酚含量以OD280/mg FW表示。

1.3 数据分析

利用SAS 8.1软件进行分析和检验，采用Duncan多重比较法进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对果实炭疽病抗病性的影响

结果表明，各处理均不同程度地抑制了芒果果实损伤接种炭疽病后的病斑直径的扩展。其中，SA+US处理的病斑直径扩展最小，接种后第6天的病斑扩展直径为8.64 mm，为对照的77.8%，显著低于对照和其它处理；SA处理效果次之，其处理果实的病斑直径显著低于US处理和对照；US处理效果较差，与对照无显著差异。

2.2 不同处理对果肉组织中相关防御酶活性的影响

在整个贮藏期，各处理果肉组织中的PAL活性呈现先升高后降低的变化趋势，且均在第6 天时达到最大值。与对照相比，各处理明显提高了果肉的PAL活性。其中SA+US处理的PAL活性最高，SA处理的活性次之，US处理的活性略高于对照。贮藏第6 天时，SA+US处理的果肉PAL活性高于对照35.5%，比SA、US单独处理分别高7.7%和12.0%。

果肉组织中的POD活性均呈现上升的变化趋势。其中，SA+US处理的POD活性始终高于对照及其它处理。例如，SA+US处理的果实在贮藏2～8 d的过程中，其平均POD活性较对照高46.2%，较SA、US单独处理分别高12.4%和33.1%。

2.3 不同处理对果皮中总酚含量的影响

3 讨论与结论

本试验研究表明，芒果果实经SA和US单独或结合处理后，均不同程度地控制了损伤接种炭疽病后病斑的扩展，但US处理与对照相比未能达显著性差异，而SA结合US处理明显增强了SA或US单独处理的效果，提高了果实的抗病性。这与SA结合US处理在其它果实上的研究结果类似[14]。

植物次生代谢在植物抗病反应中具有非常重要的作用，其中苯丙烷类代谢途径是一条重要的产生抗菌物质的途径。PAL是苯丙烷代谢途径的第一关键酶，参与植物的抗逆胁迫反应，在植物抵御病原菌侵入的过程中起着重要作用[20]。POD是该代谢途径末端相关的酶，其活性的升高不仅能有效地清除内源活性氧自由基， 而且有利于植物木质素和植保素的合成，通过使细胞壁增厚来抵御病菌的侵入和扩展从而抑制发病[21]。CHT 和GLU是2类重要的病程相关蛋白，能直接水解绝大多数真菌细胞壁的主要成分，在寄主抵御病原菌侵染过程中起着重要作用[22-23]。酚类物质作为苯丙烷途径的代谢产物，可被氧化成能对病原菌产生直接毒性的醌类物质，也可以参与被侵染部位木质素的形成，能有效抑制病原菌的扩展[24]。水杨酸作为苯丙烷代谢的中间产物之一，是植物防御反应相关酶激活链式反应中最重要的信号物质。有研究表明，水杨酸能够诱导植物产生抗病性，能间接增强寄主细胞壁对病原菌的抵抗能力或直接产生降解病原菌的酶，亦或是启动植物的次生代谢反应[25]。本研究发现，SA处理可提高果实PAL、POD、CHT和GLU的活性，促进果实总酚的积累，增强芒果的抗病性。有报道表明水杨酸可诱导芒果苯丙烷代谢途径。据报道，在枇杷[26]、甜樱桃[27]和番茄[28]等果实上也曾有过相似的研究结果，表明SA能诱导多种水果产生抗病性。超声波作为一种辅助方式，其单独处理作用效果并不明显，但与SA结合能显著提高SA单独处理的效果，这可能是超声波的空化效应，促使更多的水杨酸进入果实内部，或者更有效地加强了水杨酸和果肉组织的接触，从而增强SA的诱导抗病能力。SA结合US处理从而增强芒果果实的抗病性可能还涉及其他方面的作用机理，尚有待进一步研究。

2 mmol/L SA、US（40 kHz，500 W）单独处理和2者结合处理均能提高芒果果实对炭疽病的抗病性，其中SA结合US处理效果最好。SA结合US处理增强了单独SA或US处理的作用效果，提高了果肉组织中PAL、POD、CHT和GLU等防御相关酶的活性，并促进了果皮中总酚的积累，从而增强芒果果实的抗病性。以上结果表明，芒果果实抗病能力的提高与防御相关酶及总酚的积累存在明显的相关性。水杨酸结合超声波处理是芒果采后炭疽病防控的有效措施。

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责任编辑：林海妹