杨阳 唐宁 李正国

摘 要 SnRK2（sucrose non-fermenting 1一related protein kinase2）是脱落酸（ABA）信号转导途径中的正调控因子，广泛参与了植物的生长发育、病虫害防御、ABA和非生物胁迫等多种信号的应答反应。从番茄中分离了3个与SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6同源的基因，分别命名为SlSnRK2.2、SlSnRK2.3和SlSnRK2.6，同时构建了SlSlSnRK2.2/2.3/2.6 RNAi载体，并通过根癌农杆菌介导的叶盘法转化番茄，得到转基因番茄植株。初步表型分析结果发现转基因植株呈叶片早衰的现象。通过对乙烯信号相关基因的检测可知，转基因植株中除了ERF2表达量低于野生型，其余3个基因（ACO4、ERF1B、ERF1）的表达量均高于野生型，表明SlSnRK2.2、SlSnRK2.3和SlSnRK2.6与叶片衰老有关，可能参与ABA和乙烯信号互作，此结果对揭示植物衰老机理具有重要意义。

关键词 SnRK2s；ABA；乙烯；叶片衰老；RNAi

中图分类号 Q943.2 文献标识码 A

脱落酸（abscisic acid，ABA）是一种重要的植物激素，参与植物的干旱、盐害、病害、高低温等胁迫反应，调控种子发育和休眠，影响果实成熟和气孔关闭，促进叶片衰老[1]。然而ABA信号通路是一个复杂的系统，2009年以前，人类对它的调控机制和途径尚不是很清楚，直到2个独立的研究小组发现了ABA受体，才使得ABA的相关研究取得突破性进展[2-3]。ABA信号转导途径主要包括3个核心成分：ABA受体——PYR/PYL/RCAR，负调控因子——2C类蛋白磷酸酶（PP2C）和正调控因子--SNF1相关蛋白激酶2（SnRK2）， 它们共同构成一个双重负调控系统[4]。

SnRK2（SNF1-related protein kinase 2）属于Ser/Thr蛋白激酶家族，为植物特有的蛋白。在拟南芥、水稻中，SnRK2s都有10个成员，分别命名为SnRK2.1～SnRK2.10和SAPK1～SAPK10[5-6]。根据被ABA和NaCl诱导情况的不同，SnRK2s可以分为3个亚类，第三亚类包括SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6，能被渗透胁迫和ABA迅速诱导，在ABA信号转导通路中发挥了重要的作用[7]。除此之外，研究还发现SnRK2Ⅲ类基因具有如下功能：拟南芥的3个突变体srk2d/srk2e/srk2i对干燥的敏感性增强，对ABA敏感性降低，种子萌发率虽然提高，但是在生长过程中有缺陷[8]；超表达SnRK2.6 不仅增强了植物的含糖量、抗盐性，还能使植株长得更茂盛[9-10]。

然而以往的研究大多数都集中于SnRK2Ⅲ类基因对ABA的敏感性、种子萌发、抗逆性方面的影响，而关于其对植物生长发育的影响及其他信号转导的研究较少。本研究构建了SlSlSnRK2.2/2.3/2.6 RNAi干扰载体，通过转基因植株对SlSnRK2.2，SlSnRK2.3和SlSnRK2.6的表达进行分析，探究了SlSnRK2s对植物生长发育和其它信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

野生型番茄（Solanum lycopersicum， cv Micro Tom）于温室内种植，种植条件为：光照16 h，温度（25±2）℃；黑暗8 h，（20±2）℃，湿度80%左右。大肠杆菌JM109和农杆菌GV3101感受态细胞由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 SlSnRK2s基因的序列分析 从NCB1数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/）获得研究报道的拟南芥SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6序列，将其提交到番茄EST数据库（http：//solgenomics.net/tools/blast/index.pl）中对比，寻找同源序列，利用DNAMAN分析其开放阅读框，比较番茄中SlSnRK2s的氨基酸序列与其他物种中该蛋白的同源性；经Conserved Domain Search Service（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）及SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白保守域；利用MEGA4.0软件中的Neighbor-Joining（N-J）方法构建进化树。

1.2.2 构建RNAi 表达载体并转化番茄 （1）番茄总RNA的提取及cDNA的合成：采用Trizol法提取番茄叶片RNA，稀释50倍后测其OD260/OD280，经凝胶电泳验证质量后保存备用。以2 μg RNA为模板，参照Revert AidTM First Stand cDNA Synthesis Kit说明书合成第1链cDNA，其反转录产物保存于-20 ℃。

（2）扩增SlSnRK2s共同保守片段：分析SlSnRK2.2、SlSnRK2.3和SlSnRK2.6的共同保守序列，在保守序列内设计RNAi引物，以保存的cDNA为模板，扩增正向和反向2段保守序列。PCR反应体系为：PCR Mixture（2×）12.5 μL，正反引物（正向F：5′-TCTAGACTCTAATGCGGGGCGCT

（3）构建RNAi表达载体：正向引物加的接头为XbaⅠ和SalⅠ的酶切位点。首先将本实验保存的pcambia-HP干扰载体的质粒和正向片段用这2种酶进行双酶切，再用T4 DNA连接酶连接。连接产物经电泳回收后转化大肠杆菌。将长出来的单菌落进行PCR检测和酶切鉴定，保存验证为阳性的转化子菌液，参照质粒提取试剂盒说明书提取质粒。

反向引物加的接头为SmaⅠ和SacⅠ的酶切位点，因此先将反向保守片段和上一步得到的阳性转化子的质粒用这2种酶进行酶切处理，分别经电泳回收后再连接，然后转化大肠杆菌，筛选出阳性转化子并提取质粒，转化农杆菌GV3101。

（4）转基因植株的获得及检测：采用农杆菌介导的叶盘法[11]转化野生型番茄获得再生植株。经GUS染色初步筛选出转基因植株后，通过荧光定量PCR检测转基因植株抑制干扰程度。定量引物见表1。具体操作按照SYBR Green/ROX Master Mix试剂盒（Fermentas），仪器是Bio-Rad荧光定量PCR仪。以番茄组成型表达基因actin为内参，每个反应设置3次重复，Ct值取平均值，以2-△△Ct法计算相对表达量。反应体系为（25 μL）：2 ×SYBR Green/ROX Master Mix 12.5 μL，正反引物（5 μmol/L）各1 μL，模板1 μL。反应程序：95 ℃ 30 s，1个循环；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s， 42个循环。

1.2.3 乙烯相关基因定量分析 收取确定为转基因植株的T0代种子栽种培养，并在T1代转基因植株中检测乙烯相关基因ACO4、ERF1B、ERF1、ERF2的表达水平，以野生型番茄为对照。

2 结果与分析

2.1 SlSnRK2s序列分析

将SlSnRK2s基因的氨基酸序列与其他物种进行同源性比较，从中可以看出所推测的氨基酸序列含有磷酸化位点、活性环和SnRK2s保守区（SnRK2 box）。黑色区域表示完全相同的氨基酸残基，灰色区域表示50%以上相同，横线区域表示活性环，是蛋白激酶磷酸化的靶位点，虚线区域是SnRK2 box，“+”号表示可能的磷酸化氨基酸残基。

用MEGA4.0构建系统发育树，使用的是最小进化法，可以看出SlSnRK2.6与拟南芥中的AtSnRK2.6同源性最高，达99%；SlSnRK2.2与玉米的ZmSnRK2.3同源性较高；SlSnRK2.3与拟南芥中的AtSnRK2.2和AtSnRK2.3同源性较高。SlSnRK2.2，SlSnRK2.3，SlSnRK2.6属于SnRK2家族的第3亚类。

2.2 构建SlSnRK2s RNAi 表达载体

利用设计的特异性引物扩增SlSnRK2s共同保守序列，得到正向和反向2个片段，大小为385 bp，回收目标片段。将正向片段与载体连接后先用PCR验证是否插入，再用XbaⅠ和SalⅠ双酶切验证插入方向。将得到的阳性重组子再与反向片段连接，通过PCR和SmaⅠ、SacⅠ酶切验证后，转化农杆菌最终得到正确的阳性重组子，如图3-B。

2.3 转基因番茄鉴定及分析

2.4 转基因植株叶片衰老初步分析

试验观察到T0代转基因植株有早衰现象，并且在T1代这种现象仍然存在。检测了ACO4、ERF1B、ERF1和ERF2的相对表达情况，结果见图6[n=3，0.05>p>0.01（*）或者p<0.01（**）]。在转基因植株中，ACO4、ERF1B、ERF1的表达量都高于野生型番茄，而ERF2低于野生型。

3 讨论与结论

引起叶片衰老的成因很多，叶片衰老不仅受到周围环境的影响，也受到内部信号的调控，植物激素就是影响因素之一。生长素、细胞分裂素、赤霉素能减缓叶片衰老，而乙烯和脱落酸则加速叶片衰老。

乙烯可促进衰老，是典型的促衰激素。S-腺苷甲硫铵酸在ACC合成酶和ACC氧化酶的催化下形成乙烯[12]。乙烯响应元件结合蛋白（ERF转录因子）处于乙烯信号通路的下游，能识别乙烯合成基因的启动子，激活相关基因表达，促进乙烯合成[13]。ABA可诱导气孔关闭，是仅次于乙烯的第二个促衰剂，它对衰老的作用体现在基因转录水平上，表现为直接控制mRNA合成，或者影响mRNA的稳定性，在翻译水平上控制基因表达[14]。SlSnRK2.2、SlSnRK2.3和SlSnRK2.6与拟南芥中的SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6同源，属于SnRK2 Ⅲ亚类，参与ABA信号转导[7]，进而可能调控植物衰老。本研究构建了SlSnRK2s RNAi载体，得到的转基因植株中有叶片早衰现象，同时，ACO4、ERF1B和ERF1在转基因植株中的表达量均高于野生型，特别是ACO4和ERF1B表达量明显上升，促进了乙烯的合成，加速叶片衰老，表明SlSnRK2s与叶片衰老有关。

另外有研究报道，乙烯信号通路与ABA信号通路有一定的交叉互作，比如ERF家族中的一些基因就位于信号交叉途径中，作为连接因子促进ABA和乙烯协同调节[15]。由此初步推测SlSnRK2.2、SlSnRK2.3和SlSnRK2.6可能与ABA和乙烯信号转导的互作有关，但具体作用方式及机制需要后续的深入研究。

本研究揭示了SlSnRK2s基因的表达与植物衰老之间有着密切的联系，对进一步从分子水平上阐明其发生过程和作用机制具有重要作用，同时为植物衰老的调控技术提供重要的理论依据。

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责任编辑：林海妹