杨华庚 颜速亮 陈慧娟 邓志声

摘 要 以苗龄约8个月的中粒种咖啡袋育苗为材料，测定3种干旱胁迫强度下咖啡幼苗叶片的生理指标变化，旨在了解其对干旱胁迫的生理响应。结果表明：在轻度干旱胁迫下（土壤相对含水量为55%～60%），与对照相比，中粒种咖啡幼苗叶片的可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性极显著增加，而丙二醛（MDA）含量和相对电导率没有显著变化。但在中度干旱或重度干旱胁迫下（土壤相对含水量为40%～45%或25%～30%），可溶性蛋白含量、SOD、POD、CAT活性显著或极显著减少，而可溶性糖、脯氨酸的积累减缓，MDA含量和相对电导率迅速上升。在适度干旱胁迫下，中粒种咖啡幼苗可通过提高抗氧化酶活性和渗透调节能力来增强其对干旱胁迫的耐性。

关键词 中粒种咖啡；干旱胁迫；抗氧化作用；渗透调节；膜脂过氧化；质膜透性

中图分类号 S571.2 文献标识码 A

水分亏缺是影响咖啡生产的主要环境胁迫因子[1]。干旱不仅影响咖啡的生长发育，还会造成咖啡的大幅度减产及品质下降，给生产带来重大损失。据报道，2010年4月下旬，由于严重干旱，有近1.60 万hm2的咖啡树受害，约占云南当年咖啡种植面积的60%，造成的经济损失近6亿元[2]。冬春干旱和夏秋间歇干旱在中国咖啡种植区普遍发生，对中国咖啡生产造成不同程度的影响，是中国咖啡生产上不可忽视的重要问题。因此，研究咖啡的抗旱性对中国咖啡生产具有重要意义。水分亏缺影响咖啡植株的生理生态过程，已有研究结果表明，在干旱胁迫下，咖啡植株净光合速率下降[3-4]，PSII有效光量子产额和电子传递活性减弱[5]，光抑制增强[3]，碳代谢酶活性发生变化，糖类物质增加而淀粉含量减少[1-3]，蒸腾作用降低，叶水势减少[4]，膜脂过氧化作用加剧[6]，抗氧化酶活性增强[5，7]。目前，相关研究较多集中于干旱胁迫对咖啡光合作用的影响，而缺乏对干旱胁迫下咖啡植株的抗氧化和渗透调节机制的系统深入研究。为此，本试验采用人工控水的方法设置不同的土壤水分梯度，研究不同干旱胁迫强度对中粒种咖啡幼苗的抗氧化酶活性、渗透调节物质含量、膜脂过氧化、质膜透性的影响，旨在了解中粒种咖啡幼苗对干旱胁迫的生理响应，为中粒种咖啡栽培的水分管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

从中粒种咖啡无性系兴隆24-2植株上采摘充分成熟的果实，去除果肉后取出咖啡豆，经洗涤、适当晾干后，在砂床中播种催芽。当种子萌发至子叶平展后移入装有等量培养土的育苗钵中，育苗钵的规格为口径宽10 cm，高12 cm，培养土按腐熟牛粪 ∶ 壤土 ∶ 沙土=2 ∶ 7 ∶ 1进行配制，每钵定植咖啡苗1株。在育苗过程中，给予适当的荫蔽，做好正常的水肥管理。当幼苗经8个月左右的生长，高约10 cm，有8片叶左右时，选取株龄、生长一致的咖啡幼苗120株，参照Hsiao[8]的方法划分，对其进行4种水分处理：对照（土壤相对含水量为75%～80%）、轻度干旱胁迫（土壤相对含水量为55%～60%）、中度干旱胁迫（土壤相对含水量为40%～45%）、重度干旱胁迫（土壤相对含水量为25%～30%）。每处理重复5次，每重复6钵苗。干旱胁迫前，对各苗钵进行充分浇水，待钵内水分自然消耗至设定土壤含水量标准范围后，每天早上8： 00和傍晚18： 00用称重补水法控制土壤含水量在设定范围内，维持2 d后结束胁迫处理。随即采摘幼苗植株顶端往下第2片成熟叶测定相关生理指标。在试验期间，苗木生长的室内环境温度处于24～30 ℃范围内，相对湿度处于60%～75%范围内。

1.2 生理指标测定

粗酶液提取：称取叶样0.5 g放入研钵内，加入少量经预冷的50 mmol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%PVP），在冰浴上研磨，磨成匀浆后移入离心管内，使提取液终体积为5 mL。将提取液放置于4 ℃ 11 000 ×g冷冻离心机内离心20 min，上清液用于SOD、POD、CAT 活性、可溶性蛋白质含量的测定。酶活性的测定：SOD活性采用氮蓝四唑（NBT）法[9]测定，以抑制NBT光化还原的50%为1个酶活性单位；POD活性采用分光光度计法[10]测定，以每分钟吸光度增加0.01的酶量为1个酶活单位（U）；CAT活性采用紫外吸收法[11]测定，以每分钟吸光度减少0.01的酶量为1个酶活单位（U）。质膜透性采用电导率仪法[12]测定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法[11]测定，脯氨酸含量采用茚三酮法[9]测定，可溶性糖含量采用蒽酮比色法[9]测定，可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250染色法[9]测定。

1.3 数据处理与统计分析

实验数据采用Excel软件进行整理分析，采用SPSS 17.0统计软件中的Duncan法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对咖啡幼苗膜脂过氧化和质膜透性的影响

MDA是膜脂过氧化的主要产物之一，其含量高低反映了膜脂过氧化作用的强弱。相对电导率是衡量质膜透性大小的指标，其数值的大小反映了质膜受损的程度。由图1和图2可知，MDA含量和相对电导率随干旱胁迫强度的增加呈上升的趋势。轻度干旱胁迫时，MDA含量比对照的增加了7.03%，但两者间差异不显著。随着干旱胁迫程度的进一步加深，MDA含量显著增加。中度干旱胁迫和重度干旱胁迫时，MDA含量分别比对照的增加了17.48%和33.87%。轻度干旱胁迫时，相对电导率略有降低，只比对照的下降了1.11%，但两者间差异不显著。随着干旱胁迫强度的进一步增加，相对电导率极显著上升。中度干旱胁迫和重度干旱胁迫时，相对电导率分别比对照的增加了1.21、2.58倍。不断加大的干旱胁迫强度，促进了咖啡幼苗膜脂过氧化和质膜的损伤。

2.2 干旱胁迫对中粒种咖啡幼苗抗氧化酶活性的影响

SOD、POD和CAT是清除活性氧毒害的重要抗氧化酶。其中，SOD处于核心酶的地位，催化O2·- 发生歧化反应生成H2O2，而生成的H2O2则由POD和CAT清除。轻度干旱胁迫时，SOD、POD和CAT活性迅速增强，分别比对照的增加了37.52%、42.59%和1.41倍，差异达极显著水平。随着干旱胁迫强度的进一步增加，SOD、POD和CAT活性显著或极显著下降。重度干旱胁迫时，SOD、POD活性显著或极显著低于对照水平，分别比对照的下降了13.07%、56.36%，而CAT活性仍极显著高于对照水平，比对照的增加了43.59%。SOD、POD和CAT活性的提高起到了保护咖啡幼苗免受活性氧毒害的作用。

2.3 干旱胁迫对中粒种咖啡幼苗渗透调节物质含量的影响

可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸是植物细胞内重要的渗透调节物质，在逆境胁迫中发挥渗透调节作用。轻度干旱胁迫时，可溶性蛋白含量极显著增加，比对照的增加了4.74%。随着干旱胁迫强度的进一步增加，可溶性蛋白含量显著或极显著下降。重度干旱胁迫时，可溶性蛋白含量略比对照的下降了0.59%，但两者间差异不显著。轻度干旱胁迫时，脯氨酸含量极显著增加，比对照的增加了35.40%。随着干旱胁迫强度的不断增加，脯氨酸积累趋缓，中度干旱或重度干旱胁迫时，脯氨酸含量分别比轻度干旱胁迫的增加了8.29%和9.94%，但3种胁迫处理间差异不显著。干旱胁迫下，随着胁迫强度的加深，可溶性糖分含量显著增加；但在重度干旱胁迫时，可溶性糖含量增幅趋缓，此时可溶性糖含量仅比中度干旱胁迫的增加了7.54%，且两者间差异不显著。综上所述，干旱胁迫下，可溶性蛋白、脯氨酸和可溶糖的积累，提高了咖啡幼苗的渗透调节能力。

3 讨论与结论

干旱胁迫对植物的危害首先表现在对质膜系统的伤害，而膜脂过氧化和质膜相对透性则反映了质膜受损伤的过程。本实验结果表明，干旱胁迫下，膜脂过氧化加剧，质膜透性明显增大，是导致中粒种咖啡幼苗严重受害的重要原因之一。这与在小粒种咖啡的研究结果[6]一致。

干旱胁迫下，自由基的产生与清除机制失衡，O2·- 和H2O2等活性氧大量积累[13-15]。此时，维持较高的SOD、POD、CAT活性，有利于抑制O2·- 和H2O2的积累，防止膜系统遭受严重破坏，从而有利于增强植株的耐旱性[14]。本实验结果表明，在轻度干旱胁迫下，中粒种咖啡幼苗的SOD、POD、CAT活性极显著增强，三者协同作用，极大地提高了清除活性氧的能力，从而减缓了膜脂过氧化，使质膜系统损伤轻微，表现为MDA含量和相对电导率并没有显著的变化。Pinheiro等[7]也报道了干旱胁迫下中粒种咖啡的SOD、POD、CAT活性增强的结果。随着干旱胁迫强度超出咖啡幼苗自身的抵御能力时，活性氧的代谢平衡遭到破坏，过量积累的活性氧对酶结构造成损伤，使SOD、POD、CAT活性显著或极显著降低。由于不能有效地清除过量的活性氧，从而导致细胞结构及核酸、脂类和蛋白质分子的氧化破坏，引发或加剧膜脂过氧化作用，使质膜的流动性降低，渗漏量增加，膜蛋白、失活受体、酶和离子通道遭受损伤，破坏了质膜的结构和功能，影响了细胞内各种生理代谢的正常进行，甚至导致细胞死亡[16]，咖啡植株受害日趋严重，甚至死亡。董建华等[6]研究表明，随着干旱胁迫天数的增加，小粒种咖啡幼苗的POD活性不断上升。这与本研究结果不同，可能与试验材料和方法有关。

可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸作为重要的渗透调节物质，能增加细胞内的溶质浓度，降低植物体内的渗透势和水势，防止细胞脱水，有利于细胞保水和维持一定的膨压，以保证正常生理代谢活动的进行[17]。此外，可溶性糖和脯氨酸还起到了清除活性氧（ROS），保持膜结构完整性的作用[18]。本实验中，轻度干旱胁迫时，可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量极显著增加，有助于降低咖啡幼苗细胞的渗透势，增强细胞的防脱水和保水能力，从而维持了细胞结构的完整性，这是中粒种咖啡幼苗主动防御干旱胁迫的适应性反应。随着干旱胁迫强度的进一步增加，咖啡幼苗的可溶性蛋白含量显著下降，而可溶性糖和脯氨酸的积累趋缓。这表明在严重干旱胁迫下，咖啡幼苗的可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸的积累机制受到了严重破坏，从而减弱了渗透调节对咖啡幼苗的保护作用，使咖啡幼苗受害趋于严重。轻度干旱胁迫可能诱导了咖啡幼苗的胁迫应答基因的表达[19-20]，合成了包括抗旱防御蛋白在内的差异蛋白[21-24]，从而增加了可溶性蛋白含量。然而在重度干旱胁迫下，由于蛋白水解酶活性提高，加快了蛋白质的水解[25]，并抑制了蛋白质的合成活性，使蛋白质合成量减少，导致可溶性蛋白含量显著下降。干旱胁迫可能通过增强谷氨酰胺合成酶活性[23]，减弱脯氨酸氧化酶活性[26]来促进咖啡幼苗叶片脯氨酸的积累；也可能通过增强淀粉磷酸化酶和蔗糖磷酸合成酶活性，降低转化酶活性[27]来增加咖啡幼苗叶片可溶性糖的积累。董建华等[6]研究发现，干旱胁迫下，小粒种咖啡幼苗可溶性蛋白含量不断下降，而脯氨酸含量持续上升。Praxedes等[1]研究表明，在干旱胁迫下，耐旱性强的中粒种咖啡无性系的可溶性糖含量显著增加，而其余无性系的可溶性糖含量均无显著变化。上述结果表明，可溶性糖和脯氨酸是咖啡植株抵御干旱胁迫的2种重要渗透调节物质，可在一定程度上缓解干旱胁迫对咖啡植株所造成的伤害。

综上所述，在轻度干旱胁迫下，中粒种咖啡幼苗通过增强抗氧化酶活性和渗透调节能力来主动防御干旱危害，以维持其正常的生长发育。随着干旱胁迫强度的增加，咖啡幼苗的防御机制受到削弱，甚至受到严重破坏，植株受害日趋严重。可见，中粒种咖啡幼苗对干旱胁迫较敏感。在生产上，可通过维持轻度干旱胁迫来提高咖啡植株的抗旱能力，以增强在干旱条件下的生长适应性。

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责任编辑：黄东杰