张雅玲 方智振 赖钟雄

摘 要 Ran是一类广泛存在于真核生物中的极为保守的小G蛋白。本研究从三明野生香蕉中分离得到15条Ran家族基因DNA序列，并对基因结构、序列特征和进化关系等进行分析。结果表明，三明野生香蕉Ran家族基因与小果野蕉Ran家族基因高度同源，且具有大量多态性位点。三明野生香蕉Ran蛋白与其他植物Ran蛋白高度同源，带有GTP水解结构域、RanGAP结合结构域和酸性尾巴等Ran蛋白的典型结构域，与拟南芥AtRan3亲缘关系最近。三明野生香蕉中存在大量的Ran家族基因，预示着Ran可能具有重要的作用。本研究结果可为研究三明野生香蕉Ran家族基因的生物学功能奠定基础。

关键词 野生香蕉；Ran；生物信息学

中图分类号 S668.1 文献标识码 A

香蕉是消费量最大的重要热带鲜食水果[1]，面积和产量仅次于柑桔，具有十分重要的经济地位。中国香蕉主要分布于亚热带北缘区域，低温是影响中国香蕉产业发展的一个重要限制因素[2]。近年来，在中国南方亚热带香蕉种植区域冬春寒流频发，导致香蕉减产、迟产、劣产，甚至绝收[3]。香蕉胁迫响应机制的研究，可为通过栽培措施和遗传改良提高香蕉抗性提供科学依据，具有重要的意义。

植物不同于动物，只能通过大量基因表达的重编程，表达保护性蛋白，调整自身代谢和结构以适应外界环境条件的变化。各种环境信号需要通过许多特异的调控蛋白传导到细胞核中以启动基因的转录，并将mRNA运出细胞核并翻译成蛋白质。特异蛋白的核质分区是调控植物温度胁迫，光信号转导，激素信号转导和抗病性等诸多发育和信号转导途径的重要方式[4]。越来越多的证据表明，核质转运是植物响应激素、胁迫和环境变化等的信号转导途径中的一个关键步骤[5]。

Ran是一类在真核生物细胞核质运输中扮演重要角色的极为保守的小G蛋白[6]。Ran与蛋白质和RNA的核质转运之间密切相关。因此，Ran必然参与植物胁迫响应。超表达OsRAN2可改变水稻对盐胁迫的敏感性[7]。研究表明，热胁迫和低温胁迫可影响植物Ran蛋白的表达[8-12]。Li等[13]研究表明低磷处理可影响玉米根系中Ran B1蛋白的表达。拟南芥Ran-1蛋白参与根系对盐胁迫响应[14]。Yoshimura等[15]发现Ran蛋白与野生西瓜根系对干旱胁迫响应有关。Zhai等[16]发现长期积水可导致作用于Ran的miRNA的表达发生变化。Lee等[17]研究表明Ran基因可通过光敏色素介导的信号转导途径参与不同光源的响应。光胁迫可显著降低单细胞真核藻类中Ran的表达量[18]。Chen等[11]研究发现超表达OsRAN2可显著提搞水稻对冷胁迫的抗性。以上研究均表明，植物Ran与植物胁迫响应有关。开展Ran在植物胁迫响应过程中的作用机制研究，对于进一步探索植物胁迫响应调控机制和提高植物抗逆性具有重要意义。

目前，关于Ran的研究主要集中在动物上，植物Ran的研究相对较少。香蕉Ran家族基因的相关研究尚未见报道。本研究以抗寒性较强的三明野生香蕉为材料克隆Ran家族基因DNA序列，并采用生物信息学手段进行分析，以期为进一步研究Ran家族基因在香蕉生长发育过程中的功能与表达调控机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以三明野生香蕉组培苗为材料。以三明野生香蕉吸芽为外植体进行无菌培养体系的建立，香蕉组培苗每2个月继代1次，香蕉组培苗的培养与继代参照张锐[19]的方法。

1.2 方法

1.2.1 三明野生香蕉组培苗叶片DNA的提取 采用CATB法提取三明野生香蕉组培苗叶片的DNA，并用1.0%非变性琼脂糖凝胶电泳结合超微量紫外分光光度计，选择符合要求的DNA用于后续研究。

1.2.2 三明野生香蕉Ran基因DNA序列的克隆

1.2.3 三明野生香蕉Ran基因DNA序列及其编码的Ran蛋白的生物信息学分析 采用DNAMAN 6.0对三明野生香蕉Ran基因DNA序列及其编码的Ran蛋白进行比对分析。将三明野生香蕉Ran蛋白与拟南芥、毛果杨、葡萄和水稻Ran蛋白序列用MEGA5软件自带的ClustalW进行对，并采用邻接算法进行系统进化树构建，Bootstrap值设为1 000。用于进化树分析的拟南芥、毛果杨、葡萄和水稻Ran蛋白序列从植物基因组数据库（http：//www.phytozome.net/）提取。

2 结果与分析

2.1 三明野生香蕉Ran家族基因DNA序列克隆与序列分析

2.2 三明野生香蕉Ran蛋白氨基酸序列比对和系统进化分析

3 讨论与结论

家族成员数少是Ran家族基因不同于其他小G蛋白的一个重要特点，许多物种中均只有1个Ran基因，如人类和裂殖酵母[20]。模式植物拟南芥基因组中含有4个Ran基因[21]。根据全基因组基因预测结果，小果野蕉基因组中Ran家族基因共有9个成员。本研究共从三明野生香蕉中分离得到15条Ran家族基因DNA序列，且这些Ran家族基因仅分别与小果野蕉基因组中的4个Ran家族基因高度同源。三明野生香蕉中可能还存在与其他5个小果野蕉Ran家族基因成员同源的基因。以上结果表明，三明野生香蕉中可能存在大量的Ran家族基因成员。小果野蕉属于AA类群，仅拥有香蕉的A基因组，而三明野生香蕉属于AB类群[22]，同时拥有A和B基因组，这可能是三明野生香蕉含有大量的Ran家族基因成员的原因之一。本研究中分离得到的15条Ran家族基因DNA序列中有11条均与小果野蕉基因组中1个成员高度同源。这可能是在香蕉进化过程中发生的全基因组复制或部分基因复制的结果。研究表明香蕉可能经历过3次全基因组复制有关[23]。三明野生香蕉中Ran家族基因成员的具体数量还有待进一步研究确定。同时，香蕉基因组中大量Ran家族成员的存在预示着Ran基因可能在香蕉的生长发育过程中具有重要的作用。

三明野生香蕉、拟南芥、水稻、毛果杨和葡萄Ran蛋白的序列进行序列比对和系统进化分析结果表明Ran蛋白高度保守。表明三明野生香蕉Ran蛋白可能与其他植物的Ran蛋白具有相同或类似的功能。已有研究表明Ran参与植物胁迫响应。Chen等[11]分析了不同胁迫下水稻OsRAN2的表达模式，发现与盐胁迫和干旱胁迫相比，低温可显著影响OsRAN2的表达，且超表达OsRAN2可通过促进细胞核内微管蛋白的输出以及维持细胞分裂提高转基因植株的抗寒性。Paul和Kumar[12]研究发现低温可导致茶叶休眠组织和旺盛生长的组织中CsRan2表达量上升，而室温条件下休眠组织中CsRan2表达量下降。用150 mmol/L NaCl处理48 h后，拟南芥根系中Ran-1蛋白的丰度显著提高，表明Ran可能在盐胁迫条件下发挥着特殊的作用[14]。盐胁迫、渗透胁迫和ABA处理可降低水稻OsRAN2的转录水平，超表达OsRAN2的水稻和拟南芥植株对盐胁迫和ABA高度敏感，植株中与ABA和胁迫响应有关的基因表达量提高[7]。低温和盐渍等胁迫是导致香蕉生产损失的重要因素。目前，Ran在香蕉胁迫响应过程中的作用的相关研究还未见报道。三明野生香蕉具有较强的抗寒性[22]。本研究的结果为进一步研究Ran在三明野生香蕉对胁迫（尤其是低温胁迫）响应过程中的生物功能奠定了基础。

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责任编辑：叶庆亮