曹冰　龙翔宇　肖小虎　唐朝荣

摘 要 从橡胶树中克隆2个NADP-ME（苹果酸酶）基因的全长cDNA，分别命名为HbNADP-ME1和HbNADP-ME2。HbNADP-ME1和HbNADP-ME2 cDNA全长分别为2 428、2 139 bp，分别编码643、593个氨基酸组成的蛋白，二者的氨基酸序列一致性高达87.25%，且分别与蓖麻和杨树的一个NADP-ME序列具有较高的序列一致性。2个HbNADP-ME蛋白都含有典型的植物NADP-ME蛋白的保守结构域，均富含亮氨酸（Leu），同属于非分泌型稳定蛋白。2个HbNADP-ME基因在橡胶树不同组织中的表达存在明显差异，在根中的表达量最高，种子和花中的表达量次之；另外，HbNADP-ME1基因在胶乳中受机械伤害有下调表达趋势，HbNADP-ME2基因在胶乳中受割胶处理也表现出下调表达趋势，而低温胁迫则显著诱导2个基因在叶片和根中的表达。结果说明，HbNADP-ME基因可能参与橡胶树的抗逆应答及代谢调控（包括胶乳代谢调控）。此结果为深入揭示橡胶树中NADP-ME基因的功能奠定了基础。

关键词 巴西橡胶树；NADP-ME；基因克隆；表达分析；胁迫；代谢

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

NADP-苹果酸酶（NADP-ME）是广泛存在于原核及真核生物中的一类氧化脱羧酶，它在二价金属离子存在的条件下，与NADP+结合，催化苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸盐和二氧化碳，而NADP+则被还原为NADPH，是生物体内苹果酸代谢的关键酶之一[1-2]。在植物中，根据行使功能的不同NADP-ME可以分为光合型NADP-ME和非光合型NADP-ME。光合型的NADP-ME主要参与C4植物光合作用，它存在于C4植物维管束鞘细胞的叶绿体中或存在于景天酸代谢植物（CAM）的细胞质中，催化苹果酸氧化脱羧从而为Rubisco酶的光合碳固定提供CO2[3-9]；非光合型的NADP-ME在C3、C4和CAM植物中均存在[10]，根据亚细胞定位的不同，可将其分为质体型和细胞质型2种类型[9]。近几十年来，众多的研究结果表明，植物NADP-苹果酸酶在调节细胞的渗透势、稳定细胞质的pH以及保持植物根系的离子吸收平衡等方面起重要作用[10-11]。此外，也有不少该酶参与植物抗逆过程的报道。例如：在干旱及低温胁迫时，小麦的NADP-ME基因受诱导上调表达，同时NADP-ME的活性也明显增强，有利于细胞内pH调控和抵御干旱、低温胁迫，说明NADP-ME活性的增加是其自身形成的一种对外界环境的适应机制，但其具体的分子调控机制尚不清楚[12-16]。橡胶树是一种多年生的热带经济作物，是天然橡胶的主要来源，而天然橡胶的合成代谢和胶乳产量受多种因素影响，尤其是割胶和多种生物（病虫害）、非生物胁迫（低温、干旱、台风等）。同时，胶乳pH调控是影响胶乳糖代谢和胶乳再生的一个关键因素[18-19]。鉴于NADP-ME在植物抗逆应答和细胞pH调控上的双重作用，分离橡胶树NADP-ME基因并研究其表达调控特点，将有助于了解NADP-ME基因在橡胶树胶乳pH调节以及抗逆胁迫应答过程中的作用。本研究拟从橡胶树中克隆包含完整编码区的NADP-ME基因cDNA序列，并进一步对其推导的蛋白质序列进行生物信息学及系统进化分析，同时利用实时荧光定量PCR技术分析相关基因的组织表达特性和在割胶、机械伤害、低温和乙烯利处理条件下的表达模式。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试材料为巴西橡胶树（Heavea brasiliensis），品系为热研7-33-97，种植于中国热带农业科学院橡胶研究所试验场二队。

1.2 菌株与试剂

菌种Escherichia coli JM109由本实验室保存；逆转录试剂盒ReverAidTM First Stand cDNA Systhesis Kit购自Fermentas公司；pMD18-T Vector Ligase Kit购自Takara公司；Trans-HiFi DNA polymerase购自Fermentas公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Sigma公司；DNase I、实时荧光定量染料SYBR-Premix ExTaqTM II（Perfect Real Time）和T4 DNA连接酶购自大连宝生物公司；引物合成和测序由上海英俊生物技术有限公司完成；其它生化试剂为进口或国产分析纯试剂。

1.3 方法

1.3.1 材料处理 基因组织特异性荧光定量表达分析的材料（胶乳、树皮、叶片、种子、雄花和雌花）来自于海南省儋州市中国热带农业科学院试验场三队的正常开割树，根则是中国热带农业科学院橡胶研究所种质资源圃华于伟老师赠送的热研7-33-9组培苗根。叶片不同发育时期的材料（用于solexa测序和qRT-PCR验证）为中国热带农业科学院橡胶研究所种质资源圃1年生热研7-33-9嫁接苗。割胶和机械伤害处理均选用8 a树龄达到开割标准的未开割橡胶树，采用S/2 d3割制。割胶处理收集开割后前5个刀次的胶乳，以第1刀为对照，依次标记为1、2、3、4、5；机械伤害处理是在割线下方3～4 mm处沿割线每隔5 cm钉一个图钉；选用正常开割2年的橡胶树进行乙烯利处理，按每棵树1.5 g的量将1.5%乙烯利均匀的涂抹于割线及其上部约2 cm的割面上。机械伤害和乙烯利处理均在采胶前0、3、12、24 h共4个时间点进行，以0 h为对照，于同一时间采集胶乳；采集死皮程度分别为<30%、30%～60%、60%～90%这3种情况的橡胶树胶乳，以健康树为对照。同一实验的橡胶树均来自相同林段，每个处理选取5株，割胶后单株收集2 mL胶乳，与等体积RNA提取缓冲液混匀后带回实验室；低温处理在中国热带农业科学院橡胶研究所种质资源圃的人工气候室进行，幼苗移入装有营养液的250 mL三角瓶（锡箔纸包裹）中进行处理，处理温度为5 ℃，全程光照，设置0、3、12、24 h时间点，每个时间点设5个重复，将处理苗在不同时间放入培养箱，最后一起取材，每个时间点选3株苗取叶片、树皮和根，3种组织液氮冻存，提取RNA。

1.3.2 总RNA提取与cDNA第一链合成 胶乳总RNA的提取采用本实验室的改良方法[20]，其它组织的RNA提取方法按照常规方法进行。用Fermentas公司逆转录试剂盒进行cDNA第一链合成，操作步骤参照使用说明书。

1.3.3 巴西橡胶树NADP-ME基因全长cDNA克隆

搜索本实验室所建立的橡胶树胶乳EST数据库，获得2个HbNADP-ME基因的拼接序列，以此设计特异性引物，扩增这2个HbNADP-ME基因的系列片段，然后根据扩增得到的序列分别设计3′-RACE和5′-RACE的引物扩增3′和5′端未知片段，具体方法参照本实验室已发表文献[21]。根据所得2个NADP-ME基因的3′和5′端序列和测序验证序列，利用GENETYX软件进行序列拼接，获得2个基因的全长cDNA拼接序列。根据所得的全长拼接序列在3′和5′末端设计一对引物，使用Trans-HiFi DNA polymerase进行全长cDNA的PCR扩增，引物终浓度均为0.5 μmol/L，扩增程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min 30 s，共35个循环；72 ℃ 10 min。1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收纯化目的条带，连接到pMD18-T载体上并转化至JM109，菌落PCR鉴定后，分别挑选3个阳性单克隆送往公司测序。

1.3.4 生物信息学分析 利用软件DNAMAN 5.22对2个HbNADP-ME基因核苷酸序列进行翻译及氨基酸序列多重比对；利用在线软件Expasy（http：//web.expasy.org/protparam/）进行氨基酸组成、稳定系数、亲水系数、蛋白分子量和等电点分析；利用在线软件iPOSORT（http：//psort.hgc.jp/form.html）进行亚细胞定位预测；信号肽分析采用在线软件http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/；蛋白质亲水性分析则采用在线软件http：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl；其他物种的氨基酸序列来源于NCBI数据库，采用MEGA5.10软件，以邻近法构建进化树。

2 结果与分析

2.1 HbNADP-ME基因的克隆及序列分析

利用在线软件分析2个基因所编码蛋白的理化特性，HbNADP-ME1和HbNADP-ME2的氨基酸序列一致性高达87.25%，通过NCBI比对发现，均含有NADP-ME的5个高度保守氨基酸结构域[10]；这2个蛋白均富含亮氨酸（Leu）。HbNADP-ME1蛋白的理论等电点为6.67，不稳定系数为39.51，平均亲水系数（GRAVY）为-0.142；HbNADP-ME2蛋白的理论等电点为6.24，不稳定系数为38.91，平均亲水系数（GRAVY）为-0.137，均属于稳定型的亲水蛋白。此外，跨膜结构分析表明，这2个蛋白均是非分泌型的。

2.2 系统进化分析

根据HbNADP-ME基因编码的氨基酸序列，在NCBI非冗余蛋白序列库中进行同源检索和比对分析，获取来自不同植物的16条NADP-ME蛋白序列。将HbNADP-ME1和HbNADP-ME2与这16条NADP-ME的蛋白序列（共18条蛋白序列）进行多重比对，并构建系统进化树（图4）。18条NADP-ME蛋白序列可明显地被分为2个类群，其中HbNADP-ME1与同样来自大戟科的蓖麻（Ricinus communis）的一个NADP-ME（AAF73006.1）的亲缘关系最近，氨基酸序列一致性高达98.6%；HbNADP-ME2与同为高大乔木的毛果杨（Populus trichocarpa）的一个NADP-ME（XP_002324450.1）亲缘关系最近，氨基酸序列一致性高达99.2%，总的来看，在同一分化类群内，NADP-ME蛋白的亲缘关系与其相应来源的植物物种进化关系趋于一致。从进化树还可以看出，HbNADP-ME1和拟南芥AtNADP-ME4同聚于第一群，HbNADP-ME2和拟南芥AtNADP-ME1同聚于第二群，而根据已有报道，拟南芥AtNADP-ME4属于非光合型质体型的NADP-ME、AtNADP-ME1属于非光合型细胞质型的NADP-ME[24]。HbNADP-ME1和HbNADP-ME2的亚细胞定位和信号肽在线分析结果显示：它们定位在细胞膜、线粒体膜、内质网膜以及叶绿体膜上的可能性都不到1%，同时这2个蛋白均属于非分泌型蛋白。因此，笔者推测HbNADP-ME1可能与AtNADP-ME4一样属于非光合型质体型NADP-ME，而HbNADP-ME2可能属于非光合型细胞质型NADP-ME。

2.3 HbNADP-ME在不同组织和叶片不同发育时期的表达分析

2.4 HbNADP-ME基因在不同胁迫条件下的表达模式分析

HbNADP-ME1基因的表达变化并不明显，而HbNADP-ME2在前3刀呈现明显的下调表达，此后维持稳定；随着伤害时间的递增，HbNADP-ME1有下调表达趋势，而HbNADP-ME2无明显变化；在低温（5 ℃）处理的叶片中，HbNADP-ME1和HbNADP-ME2的表达均呈现先明显上升（3 h），接着明显下降（12 h），而后又明显上升的趋势（24 h）；在低温（5 ℃）处理的根中，2个基因表达均表现为先上升后下降的趋势，其中HbNADP-ME1表达在3 h的时候达到顶峰，而HbNADP-ME2的表达则在12 h的时候才达到顶峰。但是，2个HbNADP-ME基因在胶乳中的表达几乎都不受乙烯利处理的影响，在不同死皮程度橡胶树中2基因的表达差异也不明显。以上结果表明，割胶、伤害以及低温的胁迫对HbNADP-ME1和HbNADP-ME2的表达产生不同程度的影响，推测它们也有可能参与橡胶树的生物和非生物胁迫应答过程。

3 讨论与结论

植物抗逆性与“细胞内pH调控系统”有着密切关系，其中NADP-ME基因就是该系统的重要调节成员之一[25]，在植物生长发育及抗逆胁迫过程中扮演着重要角色。NADP-ME广泛的参与不同的代谢途径，通常认为NADP-ME为各种细胞合成反应提供还原力NADPH。例如，在产油微生物油脂合成代谢调控中，NADP-ME持续为脂肪合成酶进行链延伸提供NADPH[26]，是控制苹果酸降解的关键酶。NADP-ME在催化苹果酸氧化脱羧的过程中生成丙酮酸盐、二氧化碳和NADPH，对于保持植物细胞的渗透势，稳定细胞质的pH和保持植物根系的离子吸收平衡起着重要作用；同时，NADP-ME基因参与多种胁迫应答机制，是一种胁迫相关的基因，在植物适应干旱、高盐和高渗透等逆境环境中起重要作用[16-17，27-28]。

橡胶树天然橡胶合成和胶乳再生代谢过程均需要大量的NADPH，同时胞液pH的变化也是其代谢过程中重要的生理生化调控手段，pH的改变将影响代谢关键酶（尤其是胶乳蔗糖代谢关键酶——转化酶）的活性[18-19，29]，本文克隆的橡胶树NADP-ME基因有助于进一步了解胶乳代谢调控的分子机制。虽然不同植物中的NADP-ME可能执行不同的生理功能，但它们的氨基酸序列却高度一致，均含有5个高度保守氨基酸结构域，这5个结构域是植物NADP-ME蛋白典型的特征，可能与NADP+的结合有关[10]。本文所得到的2个HbNADP-ME家族成员与其他植物NADP-ME氨基酸序列的一致性也很高，其中HbNADP-ME1与蓖麻的一个NADP-ME氨基酸序列一致性高达98.6%，HbNADP-ME2与毛果杨的一个NADP-ME氨基酸序列一致性高达99.2%，同时它们与水稻、玉米、拟南芥、大麦、小麦、苹果等不同植物的NADP-ME氨基酸序列一致性也均在80%以上。本研究发现2个HbNADP-ME基因均在橡胶树根中的表达量最高（图5），这与烟草、拟南芥和玉米中的研究结果一致[4，24，30]，推测可能是由于土壤的酸碱度对根的影响最直接最明显，长期进化导致大部分植物的NADP-ME基因均在根中高表达。此外，这2个基因在花中的表达量也比较高，可能与花中花青素的合成需要大量的NADPH有关[31]。2个HbNADP-ME基因在叶和根中的表达显著受低温诱导，这与其它植物中NADP-ME基因的表达受干旱、低温、紫外线等多种非生物胁迫调控的报道一致[13-16]，表明HbNADP-ME基因可能在橡胶树的逆境胁迫应答与适应机制中发挥作用。当植物受到外界环境胁迫时，将产生过多的超氧自由基，其自身pH将发生变化，需要大量的NADPH参与胁迫渗透调节和胁迫清除相关物质的合成，进而参与维持正常的生理生化过程，NADP-ME在此过程中发挥重要作用[32]。

综合前人以及本文的研究结果，笔者推测所克隆得到的HbNADP-ME1和HbNADP-ME2基因可能参与橡胶树多种组织的代谢过程，包括割胶过程中的胶乳代谢，同时这2个基因还可能参与了橡胶树逆境胁迫应答，尤其在橡胶树抗低温胁迫应答过程中发挥作用。本研究结果为深入揭示橡胶树中NADP-ME基因的功能奠定基础。

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责任编辑：赵军明