周玉杰 李瑞欣 孙凯 年争好 马东东 卢涛

[摘要]目的：探讨五味子乙素（Sch B）对长波紫外线（UVA）接种人永生化角质形成细胞（Ha Cat细胞）和成纤维细胞（FB细胞）的组织工程皮肤模型损伤后的保护作用及其可能的作用机制。方法：用5J/cm2的UVA照射组织工程皮肤模型，给予不同浓度的Sch B（0.01、0.1、1、10、100μmol/L）处理UVA损伤后的组织工程皮肤模型，检测细胞超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的活性，乳酸脱氢酶（LDH）及一氧化氮（NO）含量。结果：UVA照射组织工程皮肤模型后，SOD、GSH-PX活性降低，LDH及NO含量升高，给予不同浓度的Sch B对SOD、GSH-PX活性、LDH及NO含量，有不同的影响，实验结果表明以0.01、0.1μmol/L Sch B的保护做用最强。结论：0.01、0.1μmol/L Sch B减轻UVA对组织工程皮肤模型损伤的效果最佳。

[关键词]五味子乙素；紫外线；组织工程皮肤

[中图分类号]R3181[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2014）06-0457-04

Research on effects of Sanhedrin B protective effect on the long wave ultraviolet damage tissue engineering skin

ZHOU Yu-jie1,2,3,LI Rui-xin2,SUN Kai2,NIAN Zheng-hao2,MA Dong-dong1,LU Tao3

（1.Hebe United University,Tangshan 063009,Hebe,China;2.Institute of Medical Equipment,Academy of Military and Medical Sciences,Tianjin 300161,China；3.The Affiliated Hospital of logistical College of the Chinese People's Armed Police Force,Tianjin 300162,China）

Abstract:ObjectiveThe aim to explore the effect of Sanhedrin B (Sch B) on tissue engineering skin injury caused by the long wave ultraviolet (UVA) and its possible Mechanism.MethodsTissue engineering skin was irradiated with a dose of 5 J/cm2 UVA, treated with different concentrations of Sch B（0.01,0.1,1,10,100μmol/L） treatment after UVA damage of tissue engineering skin,the detection cell superoxide diastase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-PX) activity,lactate dehydrogenase (LDH) and nitric oxide (NO) content. ResultsAfter tissue engineering skin was irradiated by UVA,the result of which reduced the SOD,GSH-PX activity,increased LDH and NO content,treated with different concentrations of Sch B,which couldaffect the SOD,GSH,LDH,NO activity,to improve the survival rate tissue engineering skin, especially with the protection of the 0.01,0.1μmol/L Sch B do with strongest.Conclusion0.01,0.1μmol/L Sch B can be a cert ain extent and reduce the UVA damage of tissue engineering skin.

Key words:Sanhedrin B;ultraviolet rays;tissue engineering skin

皮肤是接受紫外辐照最直接且面积最大的人体器官，作为机体的第一道天然保护屏障，过量紫外辐照对其所造成的损伤最为明显。其中，UVA和UVB对皮肤肿瘤的形成、皮肤老化以及皮肤屏障功能的直接破坏起着作用。作为天然紫外吸收剂，五味子乙素（Sanhedrin B）兼能吸收UVA和UVB，同时对内源氧自由基的“清除”作用远大于维生素E，五味子乙素还可以激活内源谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶(CAT)的活性从而达到“清除”自由基的作用。本研究旨在证实Sch B对UVA照射后的组织工程皮肤的保护作用，并探讨其可能的后保护机制。

1材料和方法

1.1 主要仪器和试剂MCO-AC型二氧化碳细胞培养箱，SANYO公司；多功能酶标仪，Termo Scientific公司。 Nikolski-100倒置显微镜；台式紫外线辐射仪(上海希格玛公司SS-01型，波长320～420nm)；SW-CJ-2FD型双人单面净化台，苏州净化设备有限公司；DMEM液体培养基为天润善达公司产品；胎牛血清（FBS）中国医学科学院血研所科技公司；二甲基亚砜（DMSO）；考马斯亮蓝G250为FLUKA公司产品；胰酶（Trypsin）、DMSO购于Gib co公司。Sch B分子质量400道尔顿。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及照射方法：以Ha Cat细胞和FB细胞为种子细胞，丝素蛋白修饰的聚酯聚酰胺无纺布为生物支架，复合制备的组织工程皮肤放入5%的CO2孵箱中，10%胎牛血清的DMEM培养（Ha Cat细胞模型为高糖DMEM、成纤维细胞Fibroblast，FB细胞为低糖DMEM），每两天换液一次。实验设对照组（不经UVA照射组）、模型组（UVA照射剂量为2、5、8、11 J/cm2）及Shchi组（UVA照射后分别加入Shchi 0.01、0.1、1、10、100μmol/L）。UVA的波长为320～400 NM，照射距离为1cm。倒去各组的细胞培养液，冷PBS洗2次，照射后加入无血清的培养液继续培养，通过检测细胞存活率来确定合适的照射强度。选择好合适的照射强度后，采用该强度UVA处理组织工程皮肤，然后给予不同浓度的Sch B处理UVA损伤后的组织工程皮肤。

1.2.2 噻唑蓝（MTT）实验：MTT被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测，用酶联免疫检测仪在一定波长下测定吸光度值（OD)，可以间接反应细胞生长及增殖活性。接种的模型在其生长的第2、4、6天分别接受不同能量的UVA照射，第3、5、7天弃去培养板中的培养液，加入3ml无血清培养液和2mL MTT溶液（2mg/ml），37℃孵育4h。小心吸弃上清液，每孔中加入1mLDMSO，用吸管反复吹打使蓝紫色结晶充分溶解于DMSO中。取150μl溶解后的溶液加入96孔细胞培养板内，用酶标仪在波长为490nm处测定吸光度值。计算细胞存活率，存活率=1-（对照组OD值-模型组OD值）/对照组OD值。

1.2.3 氧化损伤实验：取对数期的Ha Cat和FB细胞，胰酶消化后制备细胞悬液，以80μl细胞悬液量接种到支架上，每个支架的细胞接种数为4×105个/ml，铺到六孔板中培养，设对照组、模型组、Shchi各剂量组（0.01、0.1、1、10、100μmol/L），放入5%的CO2孵箱中，培养24h后，用5J/cm2的UVA照射，Shchi各剂量组给药，继续培养24h后，取上清液酶生化法测定细胞外的双氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）和一氧化氮（NO）的含量。

1.3 统计学方法：用SPSS 17.0进行统计学分析。实验数据均用x±s表示，各组之间均数的比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 UVA照射能量的确定：对照组和2、5、8、11J/cm2模型组细胞的存活率。由图可见随着UVA照射剂量的增大，Ha Cat细胞的存活率逐渐降低，在预实验时发现细胞存活率低于70%时，再加用Sch B时受损的Ha Cat细胞几乎不再增殖，GSH-PX、SOD、LDH、NO几乎无明显差别，不符合实际情况，所以选择5J/cm2作为实验照射剂量，见表1。

2.2 不同浓度Sch B对UVA损伤后的模型保护作用：当Sch B浓度在0.01、0.1μmol/L时，其细胞存活率最高，见表2。

2.3 不同浓度Sch B对模型SOD、GSH、LDH活力、NO含量的影响：与空白组比较，对照组的GSH、SOD活性降低，LDH、NO含量升高（P<0.05）。与对照组比较，实验组五味子乙素各保护剂量均能提高SOD、GSH活性，降低LDH、NO含量，见表3～6。

3讨论

近年随着大气臭氧层的不断破坏，导致太阳辐射强度不断增强，尤其是紫外线的辐射尤为明显[1]。致使紫外线对人体皮肤的损伤也越来越严重，UVA对皮肤的损伤程度高于UVB，会导致皮肤真皮组织中的胶原及弹力纤维的降解、皮肤光敏反应的发生[2]、皮肤的免疫功能的降低[3]以及促进皮肤肿瘤的形成[4]。 UVA辐射可诱导细胞产生活性氧簇(ROS)。ROS攻击细胞膜上不饱和脂肪酸(PUFA)，发生脂质过氧化反应，产生更多的ROS，导致皮肤细胞DNA的光损伤，表现为皮肤的表皮和真皮层的损伤。本研究通过检测SOD、GSH-PX、LDH、NO以及细胞的存活率，观察UVA对皮肤模型氧化损伤的表现以及Sch B减轻UVA对皮肤模型的损伤的作用。

Sch B是从传统中药北五味子中提取获得，为五味子中的单体活性成分，Sch B可以减轻过氧化氢（H2O2）对心肌细胞的氧化损伤，表现为MDA及LDH的降低，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性的增高[5]。五味子乙素还具有突出的抗氧化作用，其抗氧化活性强于维生素E。五味子既可通过捕获氧自由基起抗氧化作用，亦可提高细胞内抗氧化酶的活性以清除自由基。其中，五味子乙素对氧自由基、羟自由基的“清除”作用最强。氧自由基参与着细胞的增殖、分化及信号的传导[6]。在许多恶性肿瘤中，氧自由基的含量都处于较高水平。它还可以增加细胞内基质金属蛋白酶的表达，促进胶原的分解，加速皮肤的老化[7-13]。通过文献查新，发现五味子乙素（Sch B）在紫外线防护方面的研究未见报道。本实验组以Sch B所具有的基本药理性质，探讨其是否具有紫外线的防护作用，并对其主要机制进行初步探讨。随着现代药理的不断研究，Sch B在抗氧化方面也具有明显的效果。侯微等[6]研究发现，Sch B可以减轻H2O2造成Ha Cat细胞氧化应激损伤，从而起到一定的保护作用。本实验通过检测皮肤的保护性指标SOD、GSH-PX的含量和损伤性指标LDH、NO的含量发现，不同的Sch B浓度，其对组织工程皮肤保护作用是不同的，当浓度降到0.01、0.1μmol/L时，保护作用最强。因此不是Sch B浓度越高，保护作用就越强，但本实验不能解释其原因有待相关试验进一步研究。

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[收稿日期]2014-01-25[修回日期]2014-03-10

编辑/张惠娟