赵芹等

摘 要 以3个瓠瓜栽培种为供试材料，利用Ty1-copia逆转座子逆转录酶保守序列设计简并引物，PCR扩增获得260 bp左右序列条带，回收产物克隆至T载体进行测序，利用生物信息学软件分析获得的25条逆转录酶序列。结果表明，这些序列长度变化范围为218～267 bp，经DNAStar软件比对同源性在26.1%～99.6%之间，存在高度异质性，主要表现为缺失突变，核苷酸序列聚类分析分为6个家族，家族1与家族3分别占总序列数的24.0%与36.0%。翻译成氨基酸序列后，分别有2条与11条序列发生移码与终止密码子突变。与已发表物种的相应序列构建系统发育进化树，发现瓠瓜Ty1-copia型逆转座子RT序列具有一定保守性，同时也与杨树、草莓、马铃薯等有很近的亲缘关系。本研究为后续利用逆转座子开发分子标记研究瓠瓜遗传变异及进化途径奠定基础。

关键词 瓠瓜；Ty1-copia逆转座子；逆转录酶；克隆；序列分析；

中图分类号 S642.9；Q78 文献标识码 A

Cloning and Analysis of Reverse Transcriptase of

Ty1-copia-like Retrotransposons in Bottle Gourd

ZHAO Qin*， XIE Dasen， HE Xiaoming，

JIANG Biao， LUO Shaobo， PENG Qingwu， LI Mingzhu

Vegetable Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural sciences，Guangzhou， Guangdong 510640， China

Abstract A fragment of 260 bp was amplified by PCR from genomic DNA of three bottle gourd materials using degenerate primers aimed at RT conserved motifs for investigating and understanding genetic relationship， characteristics and evolution of bottle gourd Ty1-copia-like retrotransposon families. The PCR products were cloned to pMD18-T vector and positive clones were identified and sequenced. Twenty fivedifferent sequences were obtained and analyzed by some bioinformatics softwares like. The result showed that length of these RT sequences varied from 218 to 267 bp， and sequence similarities ranged from 26.1% to 99.6% by DNAStar alignmet， and high heterogeneity showed by these sequences were mainly characterized by deletion mutation. Six families were distinguished after alignment analyses of their nucleotide sequences， family1 and family2 were main members of bottle gourd retrotransposons and accounted for 24.0% and 36.0% respectively. Eleven and two sequences presented stop-codon and frame-shift mutations respectively after translated into amino acids. The amino acids cluster and alignment analyses of these sequences with other reverse transcriptase sequences in GenBank accessions showed that RT sequences of Ty1-copia-like retrotransposons in bottle gourd were conservative， and showed high homology with poplar， strawberry and potato. This work offers the basis for developing molecular markers based on retrotransposons to analyze the genetic variability and research the origin and evolution pathways of bottle gourd.

Key words Bottle gourd；Ty1-copia-like retrotransposons；Reverse transcriptase；Evolution

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.022

瓠瓜[Lagenaria siceraria（Molina）Standl.]别名瓠子、蒲瓜，隶属葫芦科（Cucurbitaceae）葫芦属（Lagenaria Ser.），原产于非洲[1]。根据形态与基因差异分为非洲与亚洲两个亚种[2-4]。中国栽培种植瓠瓜历史悠久，类型品种十分丰富，但目前对瓠瓜种质资源分子水平的遗传多样性研究较少，前人曾利用ISSR、RAPD等对部分瓠瓜种质开展了此类分析[5-7]，因此瓠瓜不同种形成与进化关系还不甚明了。本研究室通过十几年努力收集了丰富的瓠瓜资源，并育成了一些优良品种。研究瓠瓜种质资源的地理分化与系统进化，可为瓠瓜遗传育种提供依据。研究报道，植物逆转座子开发的分子标记广泛应用于种质鉴定、图谱构建和系统进化研究等方面[8-12]，为开展瓠瓜种质研究提供了重要技术。此外，瓠瓜花色、花型与瓜型、抗病性差异很大，但对于这些性状形成机制的研究并不多。研究报道逆转座子易受外界因素激活转座导致基因突变、基因组扩增及重排等，造成植物遗传变异[13-16]，在葡萄果皮颜色[17]和菜豆花色形成[18]等方面发挥着至关重要作用，因此明确逆转座子与瓠瓜遗传进化及生物学性状之间的关系具有重要意义。本研究室曾通过抑制消减技术研究抗感枯萎病节瓜突变体与病原菌互作机理时，分离得到与Ty1-copia多聚蛋白相似性很高的基因片段，推测接种病菌可能激活了节瓜逆转座子[19]。因此针对植物物种，克隆分析其逆转座子RT序列及研究其转录活性对于植物基因组组成、进化与基因的表达调控研究意义重大。

逆转座子是以RNA为中间产物在寄主基因组内不断转座增殖，影响寄主基因组的大小、结构、功能及进化等的转座元件[20]，根据DNA结构特征分为长末端重复序列（Long terminal repeat，LTR）和非长末端重复序列（Non-long terminal repeat，non-LTR）两类，LTR类包括Ty1-copia和Ty3-gypsy两亚家族，其中Ty1-copia类在植物界研究报道较多，且开发出不同的分子标记技术，已广泛应用于大麦[21]、菜豆[22]、豌豆[23]、茄子[24]等多种植物种质资源及遗传育种研究。但目前尚未有对瓠瓜逆转录酶序列克隆分析的报道。

本研究拟克隆瓠瓜Ty1-copia类逆转座子逆转录酶片段，利用生物信息学软件分析其变化特点及其与其他不同物种的相似性，以期为瓠瓜遗传进化与遗传多样性评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选用的瓠瓜3份种质材料（绿如意瓠瓜、大籽葫芦、P1杂交瓠瓜）均由本研究室保存；瓠瓜种子与2013年11月播种，待幼苗长至2片真叶时用于实验。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取及逆转录酶PCR扩增 瓠瓜基因组总DNA采用改良CTAB法[17]提取，1%琼脂糖凝胶电泳及纳米紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度，-20 ℃保存备用。

参考Yao等[25]设计的扩增Ty1-copia逆转座子RT序列的引物，引物序列为Ty1-F： 5′-ACNGCNTTR

RTNCARGG-3′，Ty1-R： 5′-AYCATYTCYTCNACY

TA-3′，其中N=A/T/C/G，R=A/G，Y=T/C；PCR反应体系总体积为25 μL，包括DNA 100 ng，2.5 μL 10×Exbuffer（含MgCl2），0.20 mmol/L dNTPs，1.0 μmol/L上下游引物，1 U ExTaqDNA聚合酶（购自TaKaRa公司）；扩增程序为95 ℃ 3 min；95 ℃ 1 min，45 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

1.2.2 PCR产物的回收、克隆及分析 PCR产物利用GeneStar回收试剂盒纯化，与pMD18-T vector 连接，转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞，用Amp抗生素和半乳糖苷酶、底物X-gal进行蓝白斑筛选，挑取白斑利用M13通用引物鉴定阳性克隆，阳性克隆菌液送与广州英骏生物技术有限公司测序。

1.2.3 逆转录酶序列的测定及序列分析 测序序列利用NCBI vecscreen程序去除载体部分，DNAstar对RT序列长度、碱基组成、G+C含量等进行分析，结合GenBank报道的其他物种序列，进行同源比对与系统发育进化树分析。

2 结果与分析

2.1 瓠瓜Tyl-copia逆转座子RT序列的分离

利用简并引物在瓠瓜3份种质中均扩增得到Tyl-copia RT基因序列，长度约为260 bp（图1），说明该类逆转座子在瓠瓜中普遍存在。

30个测序克隆经同源搜索发现，28条序列含有RT保守域，与其它物种Tyl-copia RT序列具有较高同源性，说明本研究克隆到了瓠瓜Tyl-copia逆转座子RT序列。去掉3个重复序列后，依次命名为LsRt1～25（表1）。

2.2 瓠瓜Tyl-copia逆转座子RT序列同源性分析

DNAStar软件分析表明，25条RT序列长度并不完全一致，变化范围为218～267 bp，LsRt2与LsRt4序列最长为267 bp，LsRt22与LsRt25最短为218 bp，多数序列长度为266 bp（表1与图2）；本研究的25条RT序列长度均少于前人报道的273 bp[26]，都有不同程度的缺失（6～55 bp之间），说明缺失突变是造成瓠瓜RT序列长度变化的主要原因。碱基分析发现，所有序列富含碱基AT，A、T、C、G变化范围分别为49～89、59～91、35～73和47～73 bp，AT与GC比例为1.13～1.90。由表2可以看出，瓠瓜RT序列间同源性在26.1%～99.6%之间，其中LsRt15与LsRt18同源率最高为99.6%，LsRt5与LsRt20同源率最低为26.1%（表2）。由此可见，同一简并引物扩增所得的逆转座子RT序列并不一致，在序列长度、碱基变化及序列同源性等方面存在较大差异，表明同一种质内同一类群逆转座子存在高度异质性。

2.3 瓠瓜Tyl-copia逆转座子RT序列聚类分析

25条RT序列构建系统发育进化树（图3），分析发现，25条RT序列根据遗传距离分成6个家族（family 1～6），每组代表由同一祖先而来或亲缘关系较近的遗传家系。其中family 4与family 5均分别只包含一个序列LsRt4与LsRt2，与其它家族的遗传距离较远，单独列为一族，family 1～3与family 6分别包括6、4、9和4个序列，family 1与family 3家族分别占克隆总数的24.0%与36.0%，说明这2个家族是克隆获得的瓠瓜逆转座子RT序列的主要成分；家族1包含的6条RT序列同源性在66.2%～99.6%之间，核苷酸序列长度比较一致，同时表现出一定程度的缺失突变、碱基替换及点突变导致的差异性；家族1可分为2个亚家族，均含有3个RT序列，亚家族同源性分别在66.9%～98.9%与66.2%～99.6%之间，其中LsRt15与LsRt18同源性达99.6%，这可能是两个家族在进化过程中是由一类逆转座子发生突变等造成的。家族2也分为2个亚家族，分别含有LsRt6与LsRt9以及LsRt22与LsRt25，4条序列相似性在40.8%～97.2%之间，同样表现缺失突变、碱基替换与点突变。家族3的8条与家族6的4条RT序列同源性分别在61.2%～98.1%与44.5%～58.5%之间。由此可见，碱基替换、点突变或缺失突变都可能是同一家族逆转座子产生多拷贝群的原因。同时在不同家族包含克隆数的差异，反映了各家族转座子转座过程的差异，其中包含克隆数愈多的家族历史愈久远。

2.4 瓠瓜Tyl-copia逆转座子逆转录酶的氨基酸序 列分析

参照Ty1-copia逆转座子RT氨基酸保守序列，将25条序列翻译成氨基酸序列，发现2条序列LsRt1（第34个氨基酸）与LsRt7（第41个氨基酸）发生移码突变；进一步分析表明，有11条序列发生不同程度的终止密码子突变，其中LsRt20分别在第32、39、48、60与82氨基酸处存在5个终止密码子突变，LsRt22（第12、36、59与63个氨基酸）与LsRt25（第11、36、59与63个氨基酸处）存在4个终止密码子突变；LsRt5与LsRt12均在21、46氨基酸处发生2个终止密码子突变，而LsRt1～4（第60、44、44、45氨基酸）、LsRt6（第46氨基酸）、LsRt8（第44氨基酸）均有1个终止密码子突变；有15条序列存在转录活性，包括LsRt9～11、LsRt13～19、LsRt21与LsRt23～24，占52.0%，所以移框突变和终止密码子突变可能是逆转座子发生突变与不能表达，导致逆转座子异质性的重要原因（图4）。

经DNAStar软件Clustal W同源比对，25条RT氨基酸序列同源率为17.5%～100%（表2）。从核苷酸序列遗传距离来看，亲缘关系最近的是LsRt15和LsRt18（99.6%），其氨基酸序列相似性为100.0%；而核苷酸序列相似性最低的LsRt5与LsRt20（26.1%），其氨基酸序列相似性并非最低（29.3%），最低的是LsRt7和LsRt20，仅为17.5%，这主要是由于密码子的简并性造成的，这也充分说明同一来源的逆转座子异质性较高。对各家族中亲缘关系最近与最远的RT序列进行分析发现，famlily1中LsRt15与LsRt18、LsRt21与LsRt24氨基酸序列相似性分别为100.0%与63.6%；famlily 2中LsRt22与LsRt25、LsRt9与LsRt25相似性分别为98.6%与22.9%；family 3中LsRt5与LsRt12、LsRt5与LsRt20相似性分别为98.9%与29.3%；family 6中LsRt3与LsRt7、LsRt1与LsRt7相似性分别为39.5%与26.2%；各家族所包含的克隆数越多，序列相似性越高，发生转座的时间越近，具有转座活性的可能性亦越大。因此family1与family3可能是存在具有转座活性的逆转座子家族，氨基酸序列翻译也证实了此结论，这2个家族包含10个具有转录活性的逆转座子。

2.5 瓠瓜Tyl-copia逆转座子RT序列系统进化树分析

将瓠瓜Tyl-copia逆转座子25条RT序列进行同源搜索，并与GenBank登录的33份不同植物相应序列进行比对，构建系统发育进化树（图5）。结果分析表明，来源瓠瓜的25条RT序列比较复杂，与杨树、草莓、梅、马铃薯、可可、茶树、番茄、枣、矮牵牛等有较高同源性；它们在聚类图中主要分为5组，10条瓠瓜RT序列与泻根（Bryonia cretica，CAH25548）、西洋参（Panax quinquefolius，ABU94811）、 野茶树（Camellia sinensis， CAJ09751）、缘毛杨（Populus ciliata，AAT73707）等32份植物序列同源性较高，划分在第1组；9份瓠瓜RT序列与1份玉米（Zea may，AAK84853）RT序列亲缘关系较为密切，形成第2组；第1～2组约占瓠瓜克隆RT序列总数的76%，表明瓠瓜逆转座子RT序列具一定保守性；第3组仅包括1条瓠瓜RT序列LsRt1，与第1～2组遗传距离较远；瓠瓜序列LsRt22与LsRt25形成第4组，与其它组遗传距离较远；而LsRt20与其他植物亲缘关系最远，单独为一分支，为第5组，这4条瓠瓜RT序列单独列为3组，说明瓠瓜逆转座子RT序列具有较高异质性与遗传变异率。逆转座子在植物界广泛分布，作为基因组的组成成分之一，在世代间不仅可以纵向传递，还可以横向传递，上述分析表明不同物种中存在着起源相同或相近的逆转座子，不同种属间有时存在比种属内同源性更高的逆转座子。由此可见，在瓠瓜进化史中与上述物种的Tyl-copia逆转座子RT序列间存在横向传递现象。

3 讨论与结论

瓠瓜在中国栽培历史悠久，在长江以南地区广泛种植，经济价值巨大，类型品种十分丰富，因此对瓠瓜种质资源评价对其系统演化与品种培育改良具有重要意义。前人曾利用RAPD、ISSR等分子标记对瓠瓜种质遗传多样性进行初步分析[5-7]，但不同分子标记方法各有其特异性与优势弊端[27]。利用克隆的逆转座子RT序列开发分子标记为瓠瓜遗传多样性分析提供了新的视野。本研究利用Ty1-copia逆转座子RT序列简并引物进行PCR扩增，首次从3份瓠瓜种质中扩增得到目的片段，说明Ty1-copia类逆转座子在瓠瓜中广泛存在。

逆转录转座子是植物基因组的重要组成部分，是影响基因组结构与进化的重要成分[28]。本研究扩增得到瓠瓜25条Ty1-copia逆转座子RT序列，表现很高的异质性，与其他作物如黄瓜、辣椒及苹果和火龙果等RT序列表现类似[29-33]。由于逆转座子以自身携带的无校对功能的逆转录酶产生RNA中间产物进行增殖，碱基错配率较高，且在长期进化过程中逆转座子的同源序列重组与生物体防御之间的互作关系，造成了逆转座子的高度异质性群体[34]。本研究中瓠瓜25条RT序列长度在218～267 bp之间，均小于前人报道的273 bp[25]，长度相差49 bp，小于苹果50 bp，但大于辣椒47 bp以及黄瓜17 bp；此外有10条序列存在不同程度终止密码子突变，2条序列存在移码突变。因此缺失突变、移码突变与终止密码子突变是造成瓠瓜逆转座子异质性的主要原因，与黄瓜、辣椒及苹果等作物研究结果一致[29-33]。这些都表明瓠瓜基因组内Ty1-copia逆转座子是一类较古老的元件，在转座及世代传递过程中不断积累突变才具有了今天的多样性。

正常的生长发育过程中，植物体内的逆转座子通常处于静止状态，而在受到生物和非生物胁迫后，转录活性将被激活。生物因素包括各种病原物侵染以及病原物提取物接种等[22]；非生物因素包括原生质体分离[35]、组织细胞培养[36]、机械作用、茉莉酸、水杨酸、高盐胁迫[37]等。LTR逆转座子转录活性在植物受到生物胁迫后被激活[21-22]，具有转座活性的Ty1-copia类逆转座子能诱导体细胞变异[38-41]。对瓠瓜25条逆转座子RT序列分析发现，多数序列存在碱基缺失与终止密码子突变，具有转录活性15条序列不存在终止密码子。因此推测瓠瓜种质因外部因素激活了逆转座子，插入位点发生突变的逆转座子，以无活性形式存在于基因组中，而活性转座子可能在其它胁迫下发生遗传学效应。下一步研究中，将试图在上述条件下处理瓠瓜材料研究逆转座子的转座活性或进一步发掘瓠瓜各性状变异与逆转座子的关系，将对基因组组成、进化及优良基因的发掘具有重要意义。

逆转座子不仅可进行世代纵向传递，还可进行物种间横向传递[42]。一些物种的逆转座子只能在所处的种属间或多个物种间检测到，可以推测逆转座子的起源、物种的形成及逆转座子与物种间的相互关系[43]。前人研究表明同一植物类型的逆转座子保守性较强，同一植物内的同一类型逆转座子序列变异较大，有时这种异质性种内差异大于种属间[26]。随机克隆的25条瓠瓜RT序列中，LsRt7与LsRt20的一致性只有17.5%，而与杨树、草莓、马铃薯、可可等甚至具有更高相似性，其中LsRt10与杨树（Populus ciliata，AAT73707）一致性高达89%，说明这些物种的Tyl-copia逆转座子可能具有相同起源，这可能是不同物种间逆转座子横向传递的结果，进一步说明了生物界有共同的起源。其异质性是后来伴随寄主基因组的进化逐渐积累的，同时也表明不同物种采取的进化途径有着高度一致性。逆转座子散布在基因组中成为进化的种子，与植物进化关系密切[43]。瓠瓜25条RT序列的系统聚类分析分为6个家族，不同家族里含有的反转录酶序列数量不同，反映了不同家族逆转座子的转录过程存在差异，其存在的历史地位也可能不同，对瓠瓜基因组进化作用也可能各异。由于RT序列无明显变异规律，用于开发分子标记研究种质多态性是合适的，系统进化关系需进一步求证或结合其他方法研究。

本研究首次从3个瓠瓜种质中成功克隆了Ty1-copia逆转座子RT基因序列，这不仅为进一步从瓠瓜基因组中分离各类型的逆转座子提供依据，且对探讨转座活性特征及开发分子标记评价瓠瓜遗传多样性、研究起源进化途径奠定基础。

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责任编辑：凌青根