夏海武+曹慧+王效忠

摘要：根据已知的其他物种白藜芦醇合酶cDNA保守序列设计引物，用RT-PCR技术从桑葚中扩增获得白藜芦醇合酶基因部分cDNA序列，再用RACE技术获得其两端序列，并拼接得到完整的1 442 bp白藜芦醇合酶基因。经序列分析发现，桑树白藜芦醇合酶基因开放阅读框长1 170 bp，编码389个氨基酸，氨基酸序列含有芪合酶家族特征信号区GVLFGFGPGLT和活性中心序列GCFAGGTVLR;该基因与花生芪合酶基因的核苷酸序列同源性高达82.82%，氨基酸序列的同源性高达87.15%。

关键词：桑树;白藜芦醇合酶基因;RT-PCR;RACE技术;序列分析

中图分类号： Q943.2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0017-04

收稿日期：2014-07-09

基金项目：山东省自然科学基金（编号：ZR2010CL022）;山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室（潍坊学院）开放课题（编号：2012SWKF02）。

作者简介：夏海武（1958—），男，山东潍坊人，博士，教授，从事植物生物技术研究。E-mail：xiahaiwu206@163.com。

桑葚为桑科落叶乔木桑树（Morus alba Linn.）的果实，聚花果，每年4—6月份成熟，不同生长环境、不同品种的果实之间存在差异。中国地大物博，桑葚资源丰富，全国各省份均有桑树的分布[1-2]。桑葚含有丰富的营养物质，具有食用及中药材之用，早在2 000多年前，它就成为皇帝的御用药品之一。1993年，国家卫生部把桑葚列为“既是食品又是药品”的农产品之一[3]。现已证明桑葚具有6种防病保健功能，包括防癌抗诱变、增强免疫力、保肾护肝、驻颜抗衰老、促进造血细胞生长、降低血糖血脂等[4]，这些保健功能主要依赖于桑葚中含有的一种叫白黎芦醇的芪类物质，它具有抗氧化及消除自由基功效，有防癌、抗炎、预防心血管疾病、抗衰老等功能[5-6]。白藜芦醇和其他芪类化合物均属于次生代谢物，其生物合成途径是苯丙氨酸-丙二酸，在白藜芦醇合成全过程中，白藜芦醇合酶（RS）是代谢途径中最后一个起作用的关键酶[7]，也是合成途径中唯一必需的合成酶，它催化1分子4-香豆酰辅酶A和3分子丙二酰辅酶A反应合成白藜芦醇[8]。白藜芦醇合成的底物在植物体内广泛存在，白藜芦醇的合成及含量控制主要依赖于白藜芦醇合酶基因的表达状况[9]，但大多数植物不含白藜芦醇合酶或含量很低。目前，虽然发现含有白藜芦醇的植物已有70多种，但要从天然植物中提取到高丰度的白藜芦醇比较困难，并且提取成本较高。利用基因工程技术使更多的植物产生白藜芦醇或提高植物体内白藜芦醇的含量，满足人们医疗保健需求具有重要的现实意义。 目前，已从松树、花生、葡萄、爬山虎、大黄等植物中分离到白藜芦醇合酶基因，但还没有从桑葚中克隆白藜芦醇合酶基因全长序列的报道。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料 桑树接近成熟的果实，采自山东省潍坊市农业科学院。采后洗净，每2 g为1份，装于5 mL离心管中，液氮速冻，保存于-80 ℃超低温冰箱中待用。

1.1.2 试剂盒、酶和试剂 DNA片段快速纯化/回收试剂盒，购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司;cDNA第一链合成试剂盒，购于Fermenta公司;RACE试剂盒，ClonTech公司产品;pMD 18-T Vector Kit、Marker （DL2000）、T4-DNA连接酶、5.0 U/μL Taq DNA polymerase，购于TaKaRa生物工程 （大连）有限公司;其他试剂，分析纯，均为国产或进口。

1.1.3 试验用具与耗材的预处理 用于RNA提取的研钵、药匙、镊子、50 mL离心管、试剂瓶等器具，用0.1% 焦炭酸二乙酯处理过夜;无RNA酶的专用枪头、PCR管、1.5 mL离心管等耗材，经1.1 MPa、121 ℃高压灭菌30 min或在干燥箱中60 ℃烘干，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 桑葚总RNA的提取与检测

1.2.1.1 桑葚总RNA的提取 迅速从-80 ℃冰箱中取出桑葚2 g，置于用液氮预冷的研钵中，加入PVPP 0.2 g，研磨成细粉末，在研磨时不断加入液氮以不让组织解冻;在50 mL离心管中，加入经65 ℃预热的CTAB提取缓冲液20 mL和β-巯基乙醇400 μL，倒入研磨好的桑葚细粉末，充分振摇混匀，65 ℃水浴30 min;取出，冷却至室温，加入等体积的氯仿-异戊醇（体积比49 ∶ 1），混匀，于4 ℃、20 000 g离心20 min;将上层水相移至另1支离心管中，加入1/4体积10 mol/L氯化锂，混匀，4 ℃冰箱沉淀过夜;4 ℃、20 000 g离心20 min，弃上清，用2 mol/L氯化锂洗涤沉淀1次，4 ℃、20 000 g离心 10 min，取沉淀;用2 mL无RNase的ddH2O溶解沉淀，转入4个1.5 mL离心管中，加等体积的氯仿-异戊醇（体积比49 ∶ 1）颠倒混匀，于4 ℃、20 000 g 离心20 min;将上层水相移至新的离心管中，加入1/10体积3 mol/L、pH值为5.2的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，置于-20 ℃冰箱1 h以沉淀RNA;4 ℃、20 000 g离心 15 min，弃上清，沉淀用75%乙醇漂洗2次，真空抽干5 min;加入100 μL无RNase的ddH2O充分溶解，放-20 ℃冰箱保存。

1.2.1.2 电泳检测 将电泳槽、制胶板、梳子等用DNA-RNA Away处理，晾干，用1×TAE电泳缓冲液配制1.0%琼脂糖凝胶;待凝固，点入3 μL提取的RNA样品，在预冷的1×TAE电泳缓冲液中，100 V电压条件下电泳20 min左右;观察凝胶成像仪上RNA条带的清晰度和完整性，拍照。

1.2.2 桑葚芪合酶保守区cDNA的克隆

1.2.2.1 引物设计 根据GenBank中葡萄和花生白藜芦醇合酶基因的核苷酸序列，分别设计桑葚白藜芦醇合酶基因保守区的上、下游引物。上游引物（BP1）为：5′-GGCCAGCCAATGTCTAAGATCAC-3′，下游引物（BP2）为：5′-CTGCGGAGGACAACAGTTTCAAC-3′，由上海生工生物技术有限服务公司合成。

1.2.2.2 桑葚白藜芦醇合酶保守区cDNA的RT-PCR扩增 按照试剂盒说明书进行，50 μL反应体系为：10×PCR buffer （Mg2+Plus） 5.0 μL，cDNA 2.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各2.0 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，5 U/μL Taq DNA Polymerase 0.5 μL，加ddH2O至50 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。取10 μL产物在1.0%琼脂糖凝胶、1×TAE电泳缓冲液、90 V电压条件下电泳30 min，其余产物用于回收。

1.2.2.3 目的片段的回收 从琼脂糖凝胶上切下目的片段条带称重，装入1.5 mL离心管中，按照北京鼎国昌盛生物技术有限公司的DNA片段快速纯化/回收试剂盒说明书进行操作，得到纯化的PCR产物。

1.2.2.4 目的片段与载体的连接与转化 按TaKaRa公司的pMD 18-T Vector Kit说明书，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α。大肠杆菌感受态细胞的制备及其转化采用CaCl2法。

1.2.2.5 重组质粒的PCR检测与测序 挑取白色菌斑置于加抗生素的LB培养基中，对菌液进行PCR检测，20 μL反应体系为：10×PCR buffer （Mg2+Plus） 2.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，菌液2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，5 U/μL Taq DNA Polymerase 0.3 μL，加无菌ddH2O 至20 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 15 min，30个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。取10 μL产物在1.0%琼脂糖凝胶、1×TAE电泳缓冲液、90 V电压条件下电泳30 min，在凝胶成像仪上观察并拍照，并将扩增出目的条带的样品菌液送上海生工生物工程技术有限服务公司进行测序。

1.2.3 桑葚芪合酶cDNA全长的克隆

1.2.3.1 引物设计及合成 根据保守区cDNA的测序结果和ClonTech公司BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit说明书要求，设计3′RACE上游引物（SP2）为：5′-CTATCTTAACAAGAGTGTTCCCG-3′和5′RACE下游引物（SP1）为：5′-GCGGTATTCTCAGAGCAAACAATGAG-3′，引物序列委托上海生工生物工程技术有限服务公司合成。

1.2.3.2 第一链cDNA的合成 按照试剂盒操作说明书进行，5′RACE CDS 引物序列为：5′-（T）25VN-3′，（N=A、C、G或T;V=A、G或C）;3′RACE CDS 引物序列为：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC（T）30VN-3′;BD SmartⅡ A oligo序列：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3′。

1.2.3.3 cDNA末端的快速扩增 3′RACE PCR扩增体系：PCR-Grade Water 34.5 μL，10×BD Advantage 2 PCR buffer 5.0 μL，3′-RACE-Ready cDNA 2.5 μL，UPM（10×） 5.0 μL ，10 μmol/L SP2 1.0 μL，10 μmol/L dNTP Mix 1.0 μL，50×BD Advantage 2 Polymerase Mix 1.0 μL。5′RACE PCR扩增体系：PCR-Grade Water 34.5 μL，10×BD Advantage 2 PCR buffer 5.0 μL，5′-RACE-Ready cDNA 2.5 μL，UPM（10×） 5.0 μL，10 μmol/L SP1 1.0 μL，10 μmol/L dNTP Mix 1.0 μL，50×BD Advantage 2 Polymerase Mix 1.0 μL。其中，UPM是通用引物混合物，其长序列为：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，短序列为：5′-CTAATACGACTCACTATAGGG C-3′。PCR扩增程序为：94 ℃预变性3 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环;72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。取10 μL产物在1.0%琼脂糖凝胶、1×TAE电泳缓冲液、90 V电压条件下电泳30 min，其余产物用于回收。回收的PCR产物，进行电泳、回收、连接、转化和蓝白斑筛选。

1.2.3.4 重组质粒的PCR检测 将白斑挑起，液体培养过夜，进行菌液PCR检测。20 μL反应体系为：10×PCR buffer （Mg2+Plus） 2.0 μL，菌液2.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，UPM（10×） 5.0 μL，10 μmol/L SP（5′ RACE加SP1，3′RACE加SP2） 1.0 μL，5 U/μL Taq DNA Polymerase 0.5 μL，加无菌ddH2O 至20 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性2 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30个循环;72 ℃延伸 10 min;4 ℃保存。取10 μL产物在1.0%琼脂糖凝胶、1×TAE电泳缓冲液、90 V电压条件下电泳30 min，将含重组质粒的阳性菌液送上海生工生物工程技术有限服务公司测序。

2 结果与分析

2.1 桑葚总RNA的提取结果

由图1可见，提取的桑葚总RNA样品可以看到3条带，分别为28S、18S和5S，其中28S、18S条带整齐清楚，且28S条带比18S条带更亮，5S条带非常暗淡，这说明桑葚的总RNA完整性较好，没有出现降解。RT-PCR扩增和RACE试验结果进一步证实，提取的桑葚总RNA质量较高、完整性好，能满足多数分子生物学试验要求。

2.2 桑葚白藜芦醇合酶保守区cDNA的PCR扩增与序列分析

将桑葚总RNA进行逆转录合成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板，以BP1和BP2为上、下游引物进行PCR扩增，得到1条800 bp左右的特异条带（图2）。

将该产物进行克隆、菌液PCR检测，将检测结果阳性的相应菌液送样测序，结果表明，该PCR产物的大小为806 bp。由此推导出的氨基酸序列编码268个氨基酸，其中包含植物芪合酶的活性中心和家族特征信号区，该PCR产物是桑葚白藜芦醇合酶保守区cDNA片段。

2.3 桑葚白藜芦醇合酶cDNA的RACE与序列分析

在桑葚白藜芦醇合酶保守区cDNA内，各设计1条正向引物SP2和反向引物SP1，采用BD SMARTTM RACE 技术，分别进行3′端和5′端的PCR扩增，电泳检测结果表明，3′RACE和5′RACE特异条带的大小均在500～750 bp之间（图3、图4）。将这2个特异片段进行克隆、菌液PCR检测，结果表明，3′RACE和5′RACE样品电泳都有预计大小的特异条带。测序结果表明，3′RACE产物的大小为635 bp，该序列与保守区有361 bp的重叠区，在第481～485 bp处存在加尾信号序列AATAA，在序列的末端含有19个A的poly（A）尾巴;5′RACE产物的大小为585 bp，该序列与保守区有232 bp的重叠区。由此推断，这2个片段分别是桑葚白藜芦醇合酶cDNA的3′端和5′端。

2.4 桑葚白藜芦醇合酶cDNA全长的获得与序列分析

由图5可见，桑葚白藜芦醇合酶cDNA编码区长度为 1 170 bp，编码389个氨基酸，该氨基酸序列含有芪合酶的活性中心序列GCFAGGTVLR和家族特征信号区GVLFGFGPGLT;在起始密码子ATG上游有11 bp的5′端非编码区，在终止密码子TAA下游有259 bp的3′端非编码区序列，其中，在第1286～1290 bp为加尾信号AATAA。

将桑葚与其他植物白藜芦醇合酶基因编码区核苷酸序列与氨基酸序列进行比较，结果（表1）表明，桑葚白藜芦醇合酶与花生的同源性较高，核苷酸序列和氨基酸序列同源性最高分别达到82.82%和87.15%，与葡萄的同源性在60%左右。这说明桑葚白藜芦醇合酶基因与以往克隆的白藜芦醇合酶基因有一定的进化距离。

3 结论

近年来，人们发现至少21科31属72种植物中存在白藜芦醇，日常生活中人们喜闻乐见的食物如葡萄、桑葚、花生、凤梨等含有白藜芦醇，许多常见的药用植物中也含有白藜芦醇，如决明、藜芦、何首乌、虎杖等。已有资料表明，不同类群植物中白藜芦醇的含量差异很大，且多数植物中白藜芦醇含量都很低。笔者用高效液相色谱法测得桑葚中白藜芦醇的鲜质量

含量为26.88 μg/g[10]，这说明桑葚中具有较高活性的白藜芦醇合酶基因。本试验采用RACE方法成功克隆出桑葚的白藜芦醇合酶基因全长，为白藜芦醇合酶的基因工程奠定了良好的基础。

表1 桑葚与花生、葡萄白藜芦醇合酶基因编码区核苷酸

和氨基酸序列同源性比较

植物名称 基因登录号 核苷酸序列

同源性（%） 氨基酸序列

同源性（%）

桑葚 100 100

花生 AB027606 80.68 85.60

花生 AF227963 81.37 85.09

花生 AY170347 81.20 84.83

花生 AY826726 80.94 86.38

花生 DQ124938 80.85 85.60

花生 L00952 82.82 87.15

葡萄 AB046373 60.77 66.07

葡萄 AB046374 60.69 66.33

葡萄 AB046375 60.45 65.82

葡萄 AF128861 60.22 66.84

葡萄 AF274281 64.55 65.05

葡萄 DQ366301 63.16 66.58

葡萄 DQ366302 64.29 65.56

参考文献：

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