周慧林，梅雪臣，缪礼鸿

(武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023)

棉籽粕中的粗蛋白含量达40%左右，是一种重要的蛋白质饲料资源。但由于棉籽饼粕中存在有毒物质棉酚等原因限制了其在养殖业中的大量使用。有研究表明，酵母菌、霉菌和细菌等多种微生物对棉酚均具有一定的降解作用［1-4］。通过微生物发酵作用不仅可使棉粕中的游离棉酚含量大大降低，而且能显著提高棉粕的营养物质含量及消化吸收率［5-7］。本文对酿酒酵母、产朊假丝酵母和热带假丝酵母三种酵母棉酚的培养基上的生长能力进行了比较，报道了一株具有较好的棉酚降解能力的产朊假丝酵母菌株的培养特征及用于固态发酵饲料的试验效果。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及培养基

供试菌株:产朊假丝酵母(Candida utilis)1087等6株酵母菌为实验室保存的菌株。以醋酸棉酚为唯一碳源的培养基:硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钠 0.1g/L，硫酸镁 0.5g/L，氯化钙 0.1g/L，酵母膏0.2g/L，醋酸棉酚0.25g/L。固体培养基的琼脂含量为2%。固体发酵培养基:红薯渣100g，棉籽粕 80g，酒精糟 70g，含水率 50%，pH 4.5。

1.2 不同酵母菌在含醋酸棉酚的固体培养基上的生长情况

将经过活化的酵母菌转接到以醋酸棉酚为唯一碳源的固体培养基上，于37℃培养2 d后观察其生长情况。

1.3 产朊假丝酵母生长曲线的测定

从以醋酸棉酚为唯一碳源的平板上挑取一环产朊假丝酵母1087菌种，接种到装有10mL YPD发酵液的容积为25 mL的安瓿瓶中，于37℃、170 r/min摇床培养1 d。按5%的接种量接种于以醋酸棉酚为唯一碳源的100 mL液体培养基中，37℃、170 r/min摇床培养，每隔2h取样，用血球计数板法测总菌数并在600 nm下测OD值［8］。

1.4 固态发酵条件

将产朊假丝酵母1087种子液按一定比例接入固体发酵培养基中，使接入培养基中的起始酵母菌数达到0.1亿个/g。30℃恒温培养箱中发酵24 h。发酵完毕后于80℃烘干，保存样品用于饲料分析。

1.5 游离棉酚测定

采用国标GB 13086-91“饲料中游离棉酚的测定方法”［9］。

2 结果与讨论

2.1 不同酵母菌对醋酸棉酚的利用结果

选取产朊假丝酵母、热带假丝酵母和酿酒酵母菌各2株，分别接种至醋酸棉酚为唯一碳源的培养基上进行培养，从图1中可以看出，产朊假丝酵母1087在平板上生长最好，而热带假丝酵母和酿酒酵母在平板上均生长很弱。

2.2 产朊假丝酵母1087生长曲线的测定

图1 不同酵母菌在以醋酸棉酚为唯一碳源的固体培养基上的生长情况

从图2和图3可以看出，在以醋酸棉酚为唯一碳源的液体培养基中，产朊假丝酵母1087的延缓期较短，培养20 h左右菌液的酵母菌总数达到最大值，酵母菌1087最高总菌数达2.25×108个/mL。20—26 h处于稳定期。菌液OD值的测定结果与酵母菌总数测定结果基本一致。

图2 产朊假丝酵母1087菌株在37℃下的生长曲线

图3 产朊假丝酵母1087OD600值的变化曲线

2.3 酵母菌固体发酵结果

发酵前后的样品检测结果见表1。发酵前培养料的粗蛋白含量为17.45%，发酵后的饲料粗蛋白为23.98%，粗蛋白含量提高了37.4%。发酵前培养基中游离棉酚含量为186.7 mg/kg，发酵后饲料样品的游离棉酚为120 mg/kg，发酵后饲料中棉酚含量下降了55.6%。发酵前后粗纤维含量变化不大。对发酵后样品的氨基酸含量测定结果表明(表2)，发酵后的酵母蛋白饲料样品的16种氨基酸总和为18.51%，其中赖氨酸含量达1.64%，具有较高的营养价值。

表1 发酵前后饲料样品成分检测结果

表2 发酵后饲料样品16种氨基酸含量测定结果

3 结论

通过比较不同酵母菌在以醋酸棉酚为唯一碳源的固体培养基上的生长情况，筛选出一株在醋酸棉酚培养基中生长较好的产朊假丝酵母1087。生长曲线测定结果表明，产朊假丝酵母1087在以醋酸棉酚为唯一碳源的液体培养基中，37℃，170 r/min的条件下培养20h总菌数达到最大值。以棉粕和红薯渣等为主要原料，接种产朊假丝酵母1087的固体发酵试验结果表明，发酵后的样品粗蛋白含量提高了37.4%，棉酚含量下降了55.6%，具有良好的饲用价值。

［1］张文举，许梓荣，孙建义，等.假丝酵母ZD-3与黑曲霉ZD-8复合固体发酵对棉籽饼脱毒及营养价值的影响研究［J］.中国粮油学报，2006，21(6):129-135.

［2］朱德伟，刘志鹏，蔡国林，等.高效降解棉酚菌种的筛选及棉粕发酵脱毒工艺研究［J］.中国油脂，2010，35(2):24-28.

［3］孙中超，方慧英，诸葛斌，等.高效降解棉酚菌株的分离鉴定及诱变选育［J］.微生物学通报，2011，38(8):1166-1171.

［4］Weng X Y，Sun J Y.Biodegradation of free gossypol by a new strain of Candida tropicalis under solid state fermentation:Effects of fermentation parameters［J］.Process Biochemistry，2006，41(7):1663-1668.

［5］蔡国林，郑兵兵，陆健，等.微生物发酵提高花生粕营养价值的初步研究［J］.中国油脂，2010，35(5):31-34.

［6］张昆，王春维，余岳，等.复合杂粕多菌种发酵工艺研究［J］.粮食与饲料工业，2012，(5):49-52.

［7］乔晓艳，蔡国林，陆健.微生物发酵改善棉粕饲用品质的研究［J］.中国油脂，2013，38(5):30-33.

［8］赵斌，何绍江.微生物学实验［M］.北京:科学出版社，2002.

［9］GB13086—91.饲料中游离棉酚的测定方法［S］.