刘 璐,闫 浩,夏文彤,李 诚,张庭廷(安徽师范大学生命科学学院,安徽 芜湖 241000)

镉对铜绿微囊藻和斜生栅藻的毒性效应

刘 璐,闫 浩,夏文彤,李 诚,张庭廷*(安徽师范大学生命科学学院,安徽 芜湖 241000)

采用不同Cd2+浓度处理铜绿微囊藻(Microcysis aeruginosa Kutz. )和斜生栅藻[Scenedesmus obliquus (Turp.) Kutz.],研究Cd对两种淡水藻的毒性效应.结果表明,Cd2+浓度低于 0.1mg/L促进斜生栅藻生长,高于 0.15mg/L时才转变成抑制作用,表现为毒物的低浓度促进高浓度抑制的Hormesis效应;但铜绿微囊藻对Cd2+的毒性非常敏感,0.05mg/L Cd2+作用72h后,其生长就受到明显抑制,随着浓度的升高,抑制作用越明显;受到 Cd2+的胁迫,两种藻细胞均表现为细胞膜受损,藻液可溶性蛋白质和核酸含量升高,扫描电子显微镜观察显示,藻细胞表面的絮状物随着 Cd2+的升高增多,尤其是铜绿微囊藻改变更为明显;同时,氧自由基(O2i)含量升高,过氧化物酶(POD),过氧化氢酶(CAT)活性早期均可随Cd2+浓度的增加而上升;两种藻对Cd2+均有一定吸收作用,单位藻细胞内,斜生栅藻对Cd2+的吸收能力明显好于铜绿微囊藻.镉对这两种藻的毒性机制之一可能是通过刺激氧自由基产生以及由其引起藻细胞生理生化改变而使这两种藻受到损伤,相比铜绿微囊藻,斜生栅藻不仅对 Cd2+胁迫具有较好的耐受性,且对其具有良好的吸收作用,提示斜生栅藻具有开发成水体Cd2+生物处理材料的潜质.

镉；铜绿微囊藻；斜生栅藻；毒性效应

我国重金属污染严重,而镉污染尤为突出,近年来的镉大米事件时有发生[1].镉对陆生、水生生物均有明显致毒作用,如镉能破坏某些绿藻的叶绿素,引起光合作用下降[2],同时由于其具有相当高的稳定性和难降解性通过食物链传递不仅可破坏水生生态系统平衡,还严重威胁到人类身体健康[3-4].藻类是水体食物链的重要环节,外来重金属的侵入必然使生长在水体中的各种藻类首先受到不同程度的毒害;在对高等水生植物无可见伤害的低剂量污染情况下,藻类就可能出现形态以及生理生化指标变化[5].因此,利用一些对重金属敏感的藻类作为指示生物,可以监测水体重金属污染的程度[6-9].同时,不少藻类对重金属具有比较强的富集作用[10-12],故浮游藻类被认为是一类处理水体重金属污染的优良生物材料[13],筛选适宜藻类去除水体中的重金属,被认为是一项高效、低耗、经济、环保、具有广阔应用前景的新型技术[14].国内外已有大量相关研究[12-15],如叉鞭金藻在pH值为6～7的范围内对Zn2+、Cd2+吸附效果较好[15].我国 75%的湖泊均处于不同富营养化状态[16],水体富营养常导致蓝藻水华的暴发,但是有关重金属镉对水体常见水华蓝藻铜绿微囊藻和常见绿藻斜生栅藻毒性作用研究尚鲜见报道.为了对镉污染有较为及时的生物预警以及生物治理,研究镉对具有代表性的特定目标藻铜绿微囊藻和斜生栅藻的毒性作用,进而为镉污染治理提供重要的理论与实验依据是十分必要的.

1 材料与方法

1.1 实验材料

试验藻种铜绿微囊藻(M. aeruginosa Kutz.)和斜生栅藻(S. obliquus (Turp.)Kutz.)均购自中国科学院武汉水生生物研究所,分别采用BG-11[17]和HB-4[17]培养基培养.

1.2 方法及设备

1.2.1 试剂 CdCl2:国药集团化学有限公司,分析纯.

1.2.2 仪器设备 JEOL扫描电镜(日本);Motic数码显微镜(厦门);PGX-250B光照培养箱(上海);UV-3802型紫外可见分光光度计(上海);AA320原子吸收分光光度计(上海).

1.3 实验方法

实验前一周,两种藻分别用培养基进行扩大培养.无菌条件下,在已洗净灭菌的 1000mL三角锥形瓶中加入100mL BG-11培养基,接入铜绿微囊藻藻种,摇匀,置光照培养箱中进行培养.培养条件:光照度4000lx,光暗周期12h:12h,温度(24±2)℃.每天摇动锥形瓶4次,每24h添加100mL新鲜培养基,培养至藻细胞进入对数生长期.

无菌条件下,取上述藻液加入到500mL已灭菌三角烧瓶,加入新鲜无菌BG-11或HB-4培养基后,铜绿微囊藻的起始密度为 8.5×105个/mL,斜生栅藻的起始密度为 6×105个/mL,然后加入CdCl2,使 Cd2+终浓度为 0.05,0.1,0.15,0.2mg/L,每组设3个平行,对照组不加CdCl2,培养条件同藻类的扩大培养.

1.4 相关试验指标及其测定

藻细胞的形态变化、藻生物量、藻液可溶性蛋白质含量(用OD280值表示)、藻液核酸含量(用 OD260值表示)[18]、超氧化物阴离子自由基含量、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性以及藻细胞内Cd2+含量.酶和Cd2+含量最后一天测,其余各指标每隔24h测定一次.

藻对镉的吸收处理方法为:取藻液 50mL,用15µg/mL的NaHCO3和蒸馏水各洗3次,然后烘干、称重及消化处理,用J-8000原子吸收分光光度计测定镉含量.

藻细胞形态的观察采用扫描电镜进行观察.取藻细胞,2500r/min离心收获,采用无菌洁净的培养基洗2～3次,置于2.5%戊二醛中固定2h,新鲜配制的0.1mol/LPBS缓冲液冲洗3次,最后用系列乙醇(脱水剂的乙醇浓度依次为 30%～50%～70%～80%～90%～100%)两次脱水,醋酸异戊酯置换后,CO2临界点干燥,金属喷镀,扫描电镜观察.

1.5 数据处理

实验数据的处理采用 SPSS13.0软件,图用Excel软件制作.对照组和处理组之间采用单因素方差分析,P<0.05表示有显著性差异;P<0.01表示有极显著性差异.

2 结果与讨论

2.1 镉对两种藻生物量的影响

由图 1可知,Cd2+对铜绿微囊藻有非常明显地抑制作用.Cd2+作用72h后,各处理组的藻细胞数目均低于同期对照组,差异极显著(P<0.01),说明Cd2+对铜绿微囊藻有较强的抑制作用.

图1显示,在0.05～0.2mg/L范围内,Cd2+对斜生栅藻的生长起着低促高抑的效果,即 Hormesis效应[22].如Cd2+处理24h后,浓度为0.05mg/L处理组藻细胞数明显比同期对照组高,P<0.01,说明低浓度 Cd2+对斜生栅藻的生长有促进作用;然而高浓度(0.15,0.2mg/L)处理组藻细胞数目始终低于同期对照组,作用 144h后,两处理组与对照组相比具有极显著差异(P<0.01),说明高浓度 Cd2+对斜生栅藻的生长有抑制作用.

镉是植物非必需元素,镉进入植物体内并积累到一定浓度,就会表现出毒害症状[23].本试验表明 Cd2+对铜绿微囊藻和斜生栅藻均具有明显的毒性作用,但斜生栅藻对 Cd2+的耐受性较铜绿微囊藻高,且 Cd2+对斜生栅藻生长的影响存在着Hormesis效应,即低浓度(<0.1mg/L)时能促进生长,这一结论与何学佳等的研究结果一致[24].

图1 Cd2+对两种淡水藻生长的影响Fig.1 The effects of Cd2+on the growth of M. aeruginosa and S. obliguus*与同期对照组比较,P<0.05;**与同期对照组比较,P<0.01

图2为Cd2+对两种淡水藻含量的影响,由图 2可见,Cd2+可引起铜绿微囊藻和斜生栅藻产生增多,且表现出一定的剂量效应,即Cd2+浓度越高增多越明显;斜生栅藻细胞内升高的趋势看起来较铜绿微囊藻明显,但相同浓度处理组相比,其细胞内的绝对含量远远低于铜绿微囊藻.

Cd2+对两种淡水藻的毒性机理之一可能是Cd2+胁迫下,藻体内活性氧水平增高,发生膜脂过氧化和膜蛋白的聚合作用,使细胞膜系统变性,进而导致细胞的损伤,这种破坏在对同期样品的电镜扫描图(图8)中也能清晰看出.

图2 Cd2+对两种淡水藻O2·含量的影响Fig.2 Effect of Cd2+onO2·contents of M. aeruginosa and S. obliguus*与同期对照组比较,P<0.05;**与同期对照组比较,P<0.01

2.3 OD280与OD260的变化

由图 3可知,两种藻的各处理组藻液可溶性蛋白含量随 Cd2+浓度的上升而增加,且随时间的延长而有所升高.Cd2+作用96h时,与同期对照组相比,铜绿微囊藻 0.1～0.2mg/L处理组藻液可溶性蛋白含量明显升高,且与对照组差异极显著(P<0.01);而斜生栅藻0.2mg/L处理组自Cd2+作用72h起藻液可溶性蛋白含量也明显高于同期对照组,且差异极显著(P<0.01).原因可能是 Cd2+处理细胞后,细胞膜受到损伤,细胞膜通透性增大,随处理时间的延长,细胞内部的蛋白质向胞外渗透增多.

图3 Cd2+对两种淡水藻藻液蛋白含量的影响Fig.3 Effect of Cd2+on protein content of M. aeruginosa and S. obliguus*与同期对照组比较,P<0.05;**与同期对照组相比P<0.01

图4 Cd2+对两种淡水藻藻液核酸含量的影响Fig.4 Effect of Cd2+on nucleic acid content of M. aeruginosa and S. obliguus*与同期对照组比较,P<0.05;**与同期对照组比较,P<0.01

由图4可见随着Cd2+浓度的上升,两种藻的藻液核酸含量逐渐增加.从第 4d起,铜绿微囊藻各处理组藻液核酸含量明显高于同期对照组,且差异极显著(P<0.01);而斜生栅藻0.2mg/L处理组自Cd2+作用48h起藻液核酸含量始终明显高于同期对照组,且差异极显著(P<0.01).这一变化与藻液可溶性蛋白含量变化一致.

2.4 镉对两种藻POD、CAT活性的影响

由图5可知,随着Cd2+浓度的增加,铜绿微囊藻藻细胞内的POD活性均呈先上升后下降的趋势,Cd2+浓度为0.15mg/L时活性达到最大,但即便是当 POD的活性下降时,也高于是对照组;斜生栅藻细胞内的POD活性随Cd2+浓度的上升而增加,Cd2+浓度为0.2mg/L时活性达到最大.POD是一种解毒酶,其活性的增加可能是藻的一种解毒机制.结果表明低浓度的 Cd2+促进了铜绿微囊藻POD的活性,而高浓度Cd2+对其有较强的毒性作用,藻细胞受到重创,蛋白质合成减少,使其抗氧化酶系统的活性降低.

图5 不同浓度的Cd2+处理对铜绿微囊藻和斜生栅藻POD活性的影响Fig.5 Effects of different concentrations of Cd2+exposure on POD activities of M.aeruginosa and S. obliquus

由图 6可知,铜绿微囊藻和斜生栅藻藻细胞内的CAT活性随Cd2+浓度的增加呈先上升后下降的趋势,均在Cd2+浓度为0.15mg/L时活性达到最大,且与同期对照组相比差异极显著(P<0.01). CAT是生物防止细胞过氧化的重要保护酶之一.当藻受到环境胁迫时,细胞内氧自由基浓度上升,所以抗氧化体系酶活性也会随之上升[25],试验中,在Cd2+浓度0.05～0.15mg/L的条件下,CAT酶活性升高与这一观点一致,当细胞内氧自由基浓度超过一定范围,抗氧化体系酶不能及时清除,过量的氧自由基会导致抗氧化体系酶活性降低,所以高浓度(0.2mg/L)下CAT活性下降.

图6 不同浓度的Cd2+处理对铜绿微囊藻和斜生栅藻CAT活性的影响Fig.6 Effects of different concentrations of Cd2+exposure on CAT activities of M.aeruginosa and S. obliquus

Cd2+对两种淡水藻的毒性机理还表现在对抗氧化系统的破坏:Cd2+迫使细胞内含量增加,当细胞内氧自由基浓度超过一定范围时,细胞内抗氧化酶系统不能将其及时清除,从而出现抗氧化酶活性呈现先升高后降低的现象,抗氧化酶含量减少,又进一步加大了Cd2+对两种藻的毒害.

2.5 两种藻对镉的吸收作用

某些藻类对重金属常常也表现出较强的富集能力[26-28].不同藻类对同一重金属的吸附具有明显差异性[29].目前用大型海藻处理重金属的研究比较广泛[12,26],而对于用淡水藻处理重金属的研究相对较少,有文献报道了淡水藻小球藻与重金属之间的研究,但小球藻对 Cd2+的吸附量仅为64.04mg/kg[30].本试验结果(图 7)显示:铜绿微囊藻和斜生栅藻对 Cd2+均有良好的吸收作用.在一定范围(0.05～0.2mg/L)内,两种藻对 Cd2+的吸收能力随Cd2+浓度的上升而增强,在0.2mg/L处达最大,细胞内 Cd2+含量分别为 546,769μg/g,明显高于小球藻对镉的吸收值.单位量藻细胞内,斜生栅藻对Cd2+的吸收能力要高于铜绿微囊藻.

图7 不同Cd2+浓度下铜绿微囊藻和斜生栅藻细胞内Cd2+含量Fig.7 The intra-celluar Cd2+content of M.aeruginosa and S. obliquus under different concentrations of Cd2+treatment after 6 days

2.6 不同镉浓度下两种藻的表面结构

皮带机系统安装在堆料装置臂架上，后方喂料机与皮带机进料口相连，向堆料装置皮带机喂料，物料经由皮带机至出料筒落料，从而实现堆料装置连续作业。

图8显示的是不同浓度下铜绿微囊藻藻细胞的表面结构,在不含 Cd2+的条件下,藻细胞个体分明,细胞表面光滑;随着 Cd2+浓度的上升藻细胞表面和周围絮状物逐渐增多,且出现大量黏连现象,最大浓度处理组出现细胞破碎溶解等情况,这可能是由于铜绿微囊藻受到Cd2+的胁迫后导致脂质过氧化的链锁反应,从而使膜遭受损坏和破坏.

图8 不同Cd2+浓度下铜绿微囊藻的表面结构Fig.8 Superficial structure of M. aeruginosa under different Cd2+concentrations after 6 days

图 9显示的是不同浓度下斜生栅藻藻细胞的表面结构,由图可以看出,与对照组相比,随着镉浓度的增大,处理组藻细胞表面絮凝物也逐渐增多,但比同浓度处理的铜绿微囊藻轻微.

比较两图可以看出,斜生栅藻对 Cd2+具有良好的耐性,这与前面 Cd2+对两组藻细胞生长趋势的影响一致.

图9 不同Cd2+浓度下斜生栅藻细胞的表面结构Fig.9 Superficial structure of S. obliquus under differentconcentrations Cd2+treatment after 6 days

3 结论

3.1 Cd2+对铜绿微囊藻和斜生栅藻均具有明显的毒性,但相比铜绿微囊藻,斜生栅藻对Cd2+具有较好的耐性.

3.2 Cd2+对铜绿微囊藻和斜生栅藻均的毒性主要表现为对细胞膜、抗氧化系统的破坏.

3.4 由于斜生栅藻对Cd2+具有较好的耐性及吸收性,且斜生栅藻是不产生毒素的绿藻类,对环境污染较小,因此斜生栅藻具有开发成为处理水体镉污染良好生物材料的潜能.

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Toxic effect of cadmium on Microcysis aeruginosa and Scenedesmus obliquus.

LIU Lu, YAN Hao, XIA Wen-tong, LI

Cheng, ZHANG Ting-ting*(College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China). China Environmental Science, 2014,34(2)：478～484

cadmium；M. aeruginosa；S. obliquus；toxic effect

：Toxic effect of cadmium on Microcysis aeruginosa Kutz. and Scenedesmus obliquus (Turp.) Kutz were researched by using different concentrations of Cd2+. The results showed the growth of S. obliquus was accelerated in Cd2+concentration of 0.1mg/L, and decreased in Cd2+concentration over 0.15mg/L. Toxicant could promote the growth at low concentration while restrain at high concentration, which might be an effect of hormesis. But M. aeruginosa was more sensitive to Cd2+with the growth obviously inhibited when the concentrations of Cd2+were 0.05mg/L and treat 72h, and the inhibitory effect was obvious with increasing Cd2+. The membrane permeability of the two algae changed under the stress of Cd2+, and protein and nucleic acid contents of two freshwater algae rose up. The photos of scanning electron-microscopy showed that the superficial flocs of algae increased with the rise of Cd2+concentration, especially for M. aeruginosa. Meanwhile,contents raised and the POD and CAT activities in the two algae all increased with the rise of Cd2+at the early stage. The two algae could absorb Cd2+, and S. obliquus had more adsorption ability than M. aeruginosa at the unit cell. The results indicated that the main toxic mechanisms of Cd2+imposing on two algae involved the superoxide anion radical generation that induced the physiological and biochemical changes of the algae, and hurt the algae. Compared with the M. aeruginosa, S. obliquus not only had a better tolerant of Cd2+, but a better adsorption ability of Cd2+. It indicates that S. obliquus has the potential of being a biological material to deal with water Cd2+.

刘 璐(1986-),女,河南安阳人,安徽师范大学生命科学院硕士研究生,主要研究方向为水体重金属污染的生物防治以及藻类生态学.

《中国环境科学》获评“RCCSE中国权威学术期刊(A+)”

2013-05-30

国家自然科学基金资助项目(31170443)

* 责任作者, 教授, cyhztt@mail.ahnu.edu.cn

X171.5

：A

：1000-6923(2014)02-0478-07

《中国环境科学》在武汉大学中国科学评价研究中心发布的第三届中国学术期刊评价中被评为“RCCSE中国权威学术期刊(A+)”.中国学术期刊评价按照各期刊的各指标综合得分排名,将排序期刊分为A+、A、A-、B+、B、C 6个等级,评价的6448种中文学术期刊中有1939种学术期刊进入核心期刊区,其中权威期刊(A+)327种,核心期刊(A)964种,扩展核心期刊(A-)648种.此次获得“RCCSE中国权威学术期刊(A+)”称号的环境类期刊有3种.