龙茜萍，王晓丹，谭 静，张小龙，邱树毅*

（1.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州贵酒有限责任公司，贵州 贵阳 550001；3.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025；4.贵州大学 化学与化工学院，贵州 贵阳 550025）

微生物饲料添加剂是近几十年发展起来的一种新型饲料添加剂，是指可直接喂食或在饲料中适量添加以增加有益菌、微生物酶、蛋白质，调节肠胃功能等的微生物菌剂制品[1-3]。

随着市场的需求和白酒行业的不断发展，白酒副产物丢糟大量产生，而根据白酒丢糟的特点、从循环经济以及可持续发展考虑，研究者对白酒丢糟的资源化利用进行了较多的研究[4-7]。本实验利用酱香型白酒丢糟培养酵母制备酵母饲料添加剂，以期减少丢糟污染，保护环境，达到合理利用酱香型白酒丢糟的目的[8-10]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酱香型白酒丢糟：贵州某酒厂提供；麸皮：市场购买；菌种：热带假丝酵母（Candida tropicalis）1254、产朊假丝酵母（Candida utilis）1314、酿酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）1355：中国工业微生物菌种保藏管理中心）；IS516酵母：本实验室分离得到。

麦芽汁液体培养基：130.1g麦芽汁液体培养基，1 000mL蒸馏水，自然pH。麦芽汁固体培养基（青岛高科技园海博生物技术有限公司）：145.1g麦芽汁固体培养基，1000mL蒸馏水，自然pH。

酒糟培养基：7.5g预处理的酒糟，2g葡萄糖，75mL水，pH 4.5～5.0。

硼酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）：成都科龙化工试剂厂；酒石酸钾钠（分析纯）：天津市瑞金特化学品有限公司；硫酸铜（分析纯）：重庆北碚精细化工厂；硫酸钾K2SO4（分析纯）：湖南湘中地质实验研究所；硫酸H2SO4（分析纯）、盐酸HCl（分析纯）：重庆川江化学试剂厂；葡萄糖（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SPX-258B-Z生化培养箱、BXM-50R立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；ZD-85双功能气浴振荡器：常州澳华仪器有限公司；101-1AB电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；EX224电子天平：上海菁海仪器有限公司；JJ-CJ-1FD洁净工作台：苏州市金净净化设备科技有限公司；K9840凯氏定氮仪：济南海能仪器有限公司；PHS-3C精密酸度计：上海虹益仪器仪表有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酒糟的组分测定

水分含量的测定：干燥法[11]；灰分含量的测定：灰化法[12]；还原糖含量的测定：滴定法[13]；蛋白质含量的测定：凯氏定氮法[14]；pH值的测定：取酒糟用蒸馏水按酒糟比水1∶10，在室温条件下摇匀，浸泡30min后过滤，直接用酸度计测定滤液pH值。

1.3.2 酒糟的预处理及种子液的制备

将新鲜酒糟在60℃下烘干48h，将烘干的酒糟用筛子去除谷壳，将去除谷壳后的酒糟粉碎至粉末状，以备后期试验的使用。

将保存的菌种接种到试管斜面麦芽汁琼脂培养基上活化待用。将活化好的菌种接种到灭菌麦芽汁液体培养基中，28℃培养2～3d，即为种子液。各菌剂分开培养，再分别接种到酒糟培养基后再混合，成为混合发酵液。

1.3.3 培养基的确定及菌种驯化

不同培养时间下发酵液中菌数变化：酒糟7.5g，葡萄糖1.5g，水75mL，自然pH，接种8mL种子液，28℃培养3～7d后，通过平板计数法[10]测定菌数。

不同葡萄糖下发酵液中菌数变化：酒糟7.5g，葡萄糖分别为0、0.5g、1.5g、2.0g、2.5g，水75mL，自然pH，接种8mL种子液，28℃培养5d，菌落计数。

不同接种量下发酵液中菌数变化：酒糟7.5g，葡萄糖2g，水75mL，自然pH，分别接种5mL、8mL、10mL种子液，28℃培养5d，菌落计数。

不同酒糟含量下发酵液中菌数变化：酒糟分别为5.0g、7.5g、15.0g，葡萄糖2g，水75mL，自然pH，接种8mL种子液，28℃培养5d，菌落计数。

1.3.4 单菌和混菌培养

酒糟7.5g，葡萄糖2g，水75mL混合均匀，调节pH为4.5～5.0，包扎，121℃灭菌20min。分别接种热带假丝酵母、产朊假丝酵母、酿酒酵母、实验室酵母及4种酵母种子液的混合液，28℃培养5d，当菌数达到一定数目时，向酒糟菌悬液75mL中填充28g麸皮，33℃条件下烘干20～22h，得到饲料添加剂。

1.3.5 饲料添加剂相关指标的测定

水分含量的测定：干燥法[11]；灰分含量的测定：灰化法[12]；蛋白质含量的测定：凯氏定氮法[14]；菌数的测定：平板计数法[15]；杂菌数的测定：平板计数法[15]。

2 结论与分析

2.1 酒糟的成分测定结果

贵州某酒厂提供的酱香型白酒丢糟pH值为3.94，成分测定结果如表1所示。

表1结果表明，该酱香型白酒丢糟有一定的营养成分，适合酵母生长。

表1 酱香型白酒丢糟成分测定Table 1 Composition determination of Moutai-flavor liquor distiller’s grains

2.2 不同因素对白酒丢糟发酵的影响

2.2.1 不同培养时间下发酵液中菌数变化

培养时间对发酵的影响如图1所示。由图1可知，前3d为酵母发酵的调整期，菌数较少，第4天进入对数期，发酵液菌数增加明显，第5天为稳定期，菌数达到最大，6～7d为衰亡期，发酵液菌数快速下降，因此，选择5d为酵母发酵的最佳时间。

图1 不同培养时间下发酵液中菌数变化Fig.1 Change of yeast amount in fermentation mash with different culture time

2.2.2 不同葡萄糖添加量下发酵液中菌数变化

葡萄糖的添加量对发酵的影响如图2所示。由图2可知，葡萄糖的添加量为2.0g时，发酵液菌数较大；葡萄糖添加量为2.5g时，发酵液菌数和2.0g时相差不大，因此，葡萄糖的添加量选择2.0%为最佳。

图2 不同葡萄糖下发酵液中菌数变化Fig.2 Change of yeast amount in fermentation mash with different glucose content

2.2.3 不同酵母接种量下发酵液中菌数变化

接种量对酵母发酵的影响如图3所示。从图3可知，酵母接种量为8mL，发酵液菌数较大；酵母接种量为10mL，发酵液菌数和8mL接种量时相差不大，因此选择10%为最佳酵母接种量。

图3 不同接种量下发酵液中菌数变化Fig.3 Change of yeast amount in fermentation mash with different inoculum size

2.2.4 不同酒糟含量下发酵液中菌数变化

酒糟含量对发酵的影响如图4所示。由图4可知，酒糟含量为7.5g时，发酵液菌数较大；酒糟含量为15g，发酵液菌数和酒糟含量7.5g时相差不大，因此选择料液比为1∶10为最佳酒糟含量。

图4 不同酒糟含量下发酵液中菌数变化Fig.4 Change of yeast amount in fermentation mash with different distiller’s grains content

2.3 单菌和混菌培养的结果

单菌和混菌的发酵液及制备的饲料添加剂菌数如表2所示。由表2可知，通过优化培养基和驯化后的菌种发酵5d后，发酵液中菌数达到1010CFU/mL，经填充烘干制成饲料添加剂后，菌数达到108CFU/g，是良好的复合饲料添加剂，可配制成饲料，也可直接喂食。

2.4 饲料添加剂相关指标的测定结果

测定制备好的饲料添加剂的菌数、水分、蛋白质、灰分、杂菌数，结果如表3所示。

由表3可知，制备成饲料添加剂后的菌数均达到108CFU/g，水分在9%左右，利于保存，蛋白质含量也有所增加，营养成分提高，没有杂菌。

表2 单菌和混菌的发酵液及饲料添加剂中的菌数Table 2 Single and mixed bacteria fermented mash and yeasts in feed additives

表3 饲料添加剂相关质量指标Table 3 Feed additives related quality indicators

3 结论

通过对某酒厂提供的酱香型白酒丢糟的测定，得出其水分为65.8%，灰分为2.9%，蛋白含量为9.26%，还原糖为1.44%，pH值为3.94，对酒糟进行预处理后，通过实验得出，料液比为1∶10，接种量为10%，葡萄糖为2%，培养时间为5d为最佳培养组合，当pH为4.5～5.0，比自然pH具有生长优势，得出的酒糟菌悬液菌数可达到1010CFU/mL。以酒糟菌悬液与麸皮比为5:3填充后，33℃条件下20～22h烘干后，得到酵母饲料添加剂，菌数达到108CFU/g，蛋白质含量达到22%，是一种很好的复合饲料添加剂。

[1]尹 苗，杨桂文，安利国.微生物饲料添加剂的研究进展[J].粮食与饲料工业，2001（3）：35-37.

[2]王金合.微生态饲料添加剂及其在畜禽生产中的应用研究现状[J].畜牧与饲料科学，2009，30（2）：36-38.

[3]邹明鑫，邱树毅，王晓丹，等.利用酱香型白酒丢糟生产微生物饲料添加剂的初步研究[J].酿酒科技，2013（7）：91-93.

[4]乔家运，冯占雨，王文杰，等.利用白酒糟固态发酵生产猪用生物饲料的研究及应用[J].养猪，2013（2）：17-19.

[5]刘达玉，黄 丹，夏兵兵，等.组合菌种发酵制备酒糟饲料的研究[J].四川理工学院学报，2008（12）：68-70.

[6]王肇颖，肖 敏.白酒酒糟的综合利用及其发展前景[J].酿酒科技，2004（1）：65-67.

[7]马晓建，陈俊英，张如意，等.酒糟综合利用的发展前景[J].酿酒科技，2006（4）：96-98.

[8]施安辉.国内白酒工业固体酒糟环保生态化利用的现状及前景[J].中国酿造，2006，25（3）：4-6.

[9]刘 军，牛广杰，孙东伟.混合菌种协同发酵酒糟生产菌体饲料蛋白的研究[J].酿酒科技，2009（9）：116-118.

[10]袁 颉，邱树毅，彭正东，等.固态白酒生产酒糟的资源化利用研究进展[J].酿酒科技，2012（5）：88-91.

[11]中华人民共和国卫生部.GB5009.3—2010 食品安全国家标准食品中水分的测定[S].北京：中国标准出版社，2010.

[12]吴国峰，李国全，马永强.工业发酵分析[M].北京：化学工业出版社，2006.

[13]中华人民共和国卫生部.GB5009.7—2008 食品安全国家标准食品中还原糖的测定[S].北京：中国标准出版社，2008.

[14]中华人民共和国卫生部.GB 5009.5—2010 食品安全国家标准食品中蛋白质的测定[S].北京：中国标准出版社，2009.

[15]周德庆.微生物学实验教程[M].北京：高等教育出版社，2006.