孙颖颖，沈 桥，黄晓斌，董晓柯，李光成，王长海

（1.淮海工学院 海洋学院，江苏 连云港 222005；2.南京农业大学 资源与环境科学学院，江苏 南京 210095）

0 引言

研究表明，海藻体内的某些次生代谢物是抑制微藻生长的主要原因［1－2］，已经鉴定出某些海藻体内的抑藻物质，例如墨角藻中的聚酚［3］、海头红体内的单萜［4］、川蔓体内的二萜［5］、小珊瑚藻中的溴仿［6］和孔石莼体内的不饱和脂肪酸［7］等，能显著抑制微藻的生长。海藻通过渗滤、挥发和分泌等多种方式将生物碱、酚酸、脂肪酸、硫化物、糖苷、萜类、内酯、鞣酸、有机酸和糖类等物质释放到环境中［3－7］。

前期研究表明，浒苔（Enteromorphaprolifera）和江蓠（Gracilarialemaneiformis）中含有能明显抑制米氏凯伦藻和中肋骨条藻等赤潮微藻生长的物质［8－9］，并采用甲醇浸泡制备到具有明显抑藻活性的提取物［10－11］。然而，由于采用甲醇和丙酮浸泡制备的海藻提取物含有较高含量的色素，在祛除色素过程中致使活性组分损失较多。因此，本文采用乙醚浸泡浒苔和江蓠粉末，经过滤、浓缩和液液萃取分离，制备到海藻分离组分。在此基础上，利用化合物鉴定试验（主要是生物碱、酚酸和内酯、香豆素检测）对这些海藻组分进行定性，并采用抑藻活性检测方法，确定活性组分。更进一步，采用硅胶GF254薄层层析检测，确定上述活性组分的适宜展开剂，为后续分离纯化2种海藻的抑藻活性物质奠定实验基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

中肋骨条藻无菌株由中国海洋大学提供，经进一步分离纯化后由淮海工学院江苏省海洋生物技术重点实验室保存，在f／2培养基［14］中培养，培养温度（20±0.1）℃，光照强度40μmol／（m2·s1），光暗比12∶12。

浒苔采集于青岛太平角，江蓠来自福建沿海，由苏州大学沈颂东教授提供。经适当处理后，2种海藻于40℃下烘干，粉碎至0.3mm备用。

天然海水经过脱脂棉和300目筛绢过滤，煮沸、冷却，pH和盐度分别调节至8.5和30备用（实验所用海水均作如上处理）。

1.2 2种海藻提取物的制备及其液液萃取分离

500g海藻干粉末，置于锥形瓶内，加入1 000 mL乙醚，室温下浸泡提取24h。采用虹吸法，将乙醚浸提液取出，剩余部分经2 500g下离心10min，滤纸过滤。上述干粉末再次加入乙醚，反复浸泡提取，直至干粉末变为白色。合并上述所有浸提液，40℃下减压蒸干，制备到海藻提取物。提取物加入乙醚溶解后，用0.5mol／L NaHCO3溶液萃取3次。下层减压蒸干，制备到组分A。上层加入0.1mol／L NaOH溶液萃取3次，下层减压蒸干，制备到组分B。上层待乙醚挥发完毕后，加入0.1mol／L NaOH溶液，充分振荡后，加入乙醚进行萃取，所获乙醚层减压蒸干，制备到组分C。下层加入0.1mol／L HCl溶液中和pH至中性后，加入乙醚萃取，乙醚层减压蒸干，制备到组分D。称量质量后，上述4种提取物用无水乙醇定容，4℃下保存备用。

1.3 化合物定性检测

1.3.1 酚酸鉴定试验 1mL提取物乙醇溶液加入到质量分数为1%～5%的三氯化铁溶液中，观察颜色，呈现蓝、暗绿或蓝紫色为酚酸类物质的阳性反应。

提取物乙醇溶液点样于硅胶G板上，氯仿∶丙酮∶甲酸为展开剂，三氯化铁溶液为显色剂，出现墨绿色斑点，表明存在酚酸类物质。

1.3.2 香豆素、内酯鉴定试验 加入质量分数为1%的氢氧化钠溶液1mL到1mL提取物乙醇溶液中，沸水浴3～4min，溶液比未加热时澄清。加入质量分数为2%的盐酸溶液1mL酸化，静置，溶液变浑浊，表明存在香豆素、内酯类物质。

提取物乙醇溶液点样于硅胶G板上，石油醚∶乙酸乙酯为展开剂，254nm下呈现蓝色荧光，表明存在香豆素、内酯类物质。

1.3.3 生物碱鉴定试验 1mL提取物乙醇溶液加入到碘化汞钾试剂中，充分混匀后，静置，出现白色或浅黄色沉淀为阳性反应。

提取物乙醇溶液点样于硅胶G板上，氯仿∶甲醇为展开剂，碘化铋钾为显色剂，出现橘红色斑点，表明含有生物碱类物质。

1.3.4 黄酮鉴定试验 加入适量浓氨水到1mL提取物乙醇溶液中，出现亮黄或橙色颜色反应为阳性反应。

提取物乙醇溶液点样于硅胶G板上，254nm下呈现亮黄或黄绿色荧光，表明存在黄酮类物质。

1.4 抑藻活性检测

在f／2培养基中，添加实验“1.2”制备的8种组分。随后，接种中肋骨条藻，接种细胞数量均为25×104mL－1，8种组分终质量浓度为1.40g／L，同时设定添加相同体积无水甲醇的对照组，每个处理3个重复。所有培养瓶置于GXZ－260B智能型光照培养箱中培养10d，温度（26±1）℃，光照强度40μmol·（m2·s）－1，光暗比为12∶12。每天定时摇动培养瓶3次，以防止微藻附壁生长。每隔1d从培养瓶中取1mL培养液，用Lugol’s试剂固定后，计数藻细胞数量的变化。取样后向培养瓶中加入1mL浓缩f／2培养液，以维持培养液体积恒定。

1.5 硅胶GF254薄层层析检测

点样粗提物的乙醇溶液于硅胶GF254上，以氯仿∶甲醇（16∶1）、氯仿∶甲醇（8∶1）、氯仿∶丙酮∶甲酸（15∶3∶2）和石油醚∶乙酸乙酯（1∶1）为展开剂，254 nm下观察各分离组分的展开情况，以确定上述组分后续分离纯化的适宜展开剂。

1.6 数据处理

实验数据采用SPSS11.5软件包进行独立样本检验统计分析，p＜0.05为显著性差异，p＜0.01为极显著性差异。

微藻生长抑制率I＝（1－N／N0）×100%，式中，N为处理组藻细胞数量（104mL－1）；N0为对照组藻细胞数量（104mL－1）。

2 结果和分析

2.1 2种海藻提取物的制备及其液液萃取分离

分别以500g浒苔干粉末和500g江蓠干粉末为原料，制备到2.753g墨绿色浒苔提取物和5.628 g暗棕色江蓠提取物。上述2种提取物经液液萃取分离后，分别制备到4种分离组分，质量和得率（质量分数）如表1所示。

表1 2种海藻提取物的液液萃取分离Table 1 Liquid－liquid extraction of two kinds of extracts from two macroalgae

2.2 2种海藻分离组分的化合物鉴定试验

上述8种组分用无水甲醇定容，使其终质量浓度均为40g／L。取适量溶液进行生物碱、酚酸和内酯、香豆素检测，结果如表2所示。

表2 2种海藻分离组分的化合物鉴定试验结果Table 2 Compound identification test of fractions of two kinds of extracts from two macroalgae by liquid－liquid extraction

由表2可以看出，浒苔分离组分A含有酚酸，组分B含有内酯、香豆素，组分C含有生物碱，组分D并未检测出生物碱、酚酸和内酯、香豆素等物质；江蓠分离组分A和组分B含有内酯、香豆素，组分C含有生物碱、酚酸和内酯、香豆素，组分D同样未检测出生物碱、酚酸和内酯、香豆素等物质。

2.3 2种海藻分离组分的抑藻活性

图1表明，浒苔4种分离组分中，组分A、组分C和组分D对中肋骨条藻表现出明显的（p＜0.05）抑制作用。第8d，对中肋骨条藻的生长抑制率超过58%。其中，组分A致使中肋骨条藻细胞接近死亡（第6d）。组分B则明显（p＜0.05）促进了中肋骨条藻的生长。从第4d开始，使得添加组分B的实验组藻细胞数量为对照组藻细胞数量的2.0倍，并且，这种促进生长现象一直持续到实验结束。

江蓠4种分离组分中，组分B、组分C和组分D对中肋骨条藻表现出明显的（p＜0.05）抑制作用。第6d，对中肋骨条藻的生长抑制率在71%以上。在实验设定的质量浓度下，组分A未对中肋骨条藻的生长产生明显（p＞0.05）影响（图1）。

图1 2种海藻分离组分对中肋骨条藻生长的影响Fig.1 Effect of fractions of two kinds of extracts from two macroalgae by liquid－liquid extraction on the growth of Skeletonema costatum

2.4 2种海藻分离组分的硅胶GF254薄层层析分离

在上述实验基础上，选定浒苔分离组分A、组分B和组分C以及江蓠分离组分B和组分C，采用硅胶GF254薄层层析进行检测，以确定后续分离纯化的适宜展开剂。表3列出了2种海藻分离组分的硅胶GF254薄层层析分离结果。

表3 2种海藻分离组分的硅胶GF254薄层层析分离Table 3 Silica gel GF254thin－layer chromatography of fractions of two kinds of extracts from two macroalgae by liquid－liquid extraction

在表3中，浒苔分离组分A展开剂为氯仿∶丙酮∶甲酸（16∶2∶2），出现5个比较明显的斑点。浒苔分离组分B和江蓠分离组分B展开剂为石油醚∶乙酸乙酯（1∶1）和石油醚∶乙酸乙酯（1∶8），依次出现4个斑点和5个斑点。浒苔分离组分C以氯仿∶甲醇（8∶1）为展开剂，出现6个斑点。江蓠分离组分C在氯仿∶甲醇（16∶1）展开，出现6个斑点；在氯仿∶丙酮∶甲酸（16∶2∶2）展开下，出现4个斑点；以石油醚∶乙酸乙酯（1∶2）为展开剂时，出现3个斑点。上述5种组分经选定的展开剂展开后，在254nm下检测，发现所出现斑点比较分散，展开效果较好，利于后续的分离纯化。本文中，由于2种海藻的分离组分D的化合物定性检测结果未知，因此，目前尚未进行硅胶GF254薄层层析检测。

3 讨论

目前，已经证实海藻分泌的萜类［4－5］、不饱和脂肪酸类［7］和酚酸类［12－16］物质具有明显的抑藻活性。本文通过调节不同的酸碱性改变物质的解离状态，进而实现浒苔和江蓠乙醚提取物的初步分离，依次使浸提液弱碱化、强碱化、再酸化，制备到含有不同物质的组分（表1和表2）。同时，抑藻活性检测表明，浒苔分离组分A、组分C、组分D和江蓠分离组分B、组分C、组分D均显著抑制了中肋骨条藻的生长（图1）。表2中，浒苔分离组分A和江蓠分离组分C均含有酚酸类物质。这表明此2种海藻中的酚酸类物质很可能是具有抑藻活性的物质。浒苔分离组分C中存在生物碱类物质，江蓠分离组分B中含有内酯、香豆素类物质，而此2种组分同样明显抑制了中肋骨条藻的生长，表明生物碱和内酯、香豆素很可能也具有抑藻活性。浒苔分离组分D和江蓠分离组分D中均未检测出酚酸、生物碱和内酯、香豆素等物质，因此，其抑藻成分还有待进一步研究。

此外，值得注意的是，浒苔分离组分B明显促进了中肋骨条藻的生长（图1），而检测发现组分B中含有内酯、香豆素（表2）。结果表明，此组分中很可能具有促进生长的物质，或抑藻活性物质浓度较低，在低浓度时对中肋骨条藻的生长表现出了促进作用，具体原因还需要进一步研究。更进一步，采用硅胶GF254薄层层析对浒苔分离组分A、组分B和组分C以及江蓠分离组分B和组分C进行检测，确定了此5种组分后续分离纯化的适宜展开剂，为后续研究浒苔和江蓠抑藻活性物质的分离纯化奠定了良好的实验基础。

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