周 昆，朱桃桃，张 玥，代 志

（1.天津中医药大学中医药研究院，方剂学教育部重点实验室，天津 300193；2.华润三九医药股份有限公司研发中心，深圳 518110）

壮骨关节丸对大鼠肝微粒体P450的影响*

周 昆1，朱桃桃1，张 玥1，代 志2

（1.天津中医药大学中医药研究院，方剂学教育部重点实验室，天津 300193；2.华润三九医药股份有限公司研发中心，深圳 518110）

[目的]考察壮骨关节丸对大鼠肝微粒体细胞色素P450的影响。[方法]壮骨关节丸及其两个新工艺按含生药2.1 g/kg连续给大鼠灌胃7 d，末次药后24 h断头处死大鼠并取肝脏，用钙沉降法制备肝微粒体。在体外用含氨苯砜、非那西丁、奥美拉唑、氯唑沙宗的cocktail探针代谢来考察肝微粒体CYP3A、CYP1A2、CYP2C19、CYP2E1的活性。[结果]cocktail探针在体外肝微粒体系统中代谢1 h后，包括壮骨关节丸及其两个新工艺的给药组剩余氯唑沙宗浓度显著高于对照组，而奥美拉唑、非那西丁、氨苯砜浓度与对照组之间差异无统计学意义。[结论]壮骨关节丸可以抑制大鼠肝脏CYP2E1活性，但对CYP1A2、CYP3A及CYP2C19无显著影响。

壮骨关节丸；细胞色素P450；CYP1A2；CYP2E1；CYP2C19；CYP3A

壮骨关节丸主要用于治疗骨性关节炎、腰肌劳损，自20世纪90年代上市以来其疗效得到了证实[1-3]，被《中国药典》收载，但和大部分复方中成药一样，限于时代技术和观念的影响，缺乏足够的现代药理毒理学研究支持。由于极少数患者在长时间连续使用壮骨关节丸后出现肝功能异常等肝毒性表现，笔者进行了有关壮骨关节丸肝毒性药材的筛选研究[4]，并针对毒性药材进行了减毒研究，最后根据壮骨关节丸制备工艺不同分为壮骨1号方和壮骨2号方。研究细胞色素P450的活性对阐述药物的体内代谢以及联合用药的安全性等具有重要意义，为此本研究用氨苯砜、非那西丁、奥美拉唑、氯唑沙宗组合cocktail探针在体外肝微粒体中的代谢的方法，考察了壮骨关节丸及其两个新工艺壮骨1号方和壮骨2号方对P450活性的影响，以帮助了解壮骨关节丸的毒性机制和用药安全性。

1 材料与方法

1.1 受试药 壮骨关节丸（批号1006103）、壮骨1号方（批号1006102）、壮骨2号方（批号1006101），均由华润三九医药股份有限公司提供。

1.2 试剂与仪器 氨苯砜（Fluka）；非那西丁，氯唑沙宗（Alfa Aesar）；奥美拉唑（中检所）NADPH，Tris（Sigma）；甲醇，乙腈（国产色谱纯）；CaCl2，KCl，K2HPO4，H3PO4，HCl等（国产分析纯）。

AX205分析天平（梅特勒托利多），L8-80M离心机（Beckman），N-EVAP111氮吹仪（Organomation），Waters600E配自动进样系统（Waters 2487紫外检测器）。

1.3 动物及分组给药 Wistar大鼠40只，购自天津市山川红实验动物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（津）2009-0001。根据随机数字表法随机分为对照组、壮骨关节丸组、壮骨1号方组和壮骨2号方组，每组10只，雌雄各半。3个给药组按2.1 g/kg连续灌胃7 d，对照组给予相应体积的饮用水，末次给药后24 h断头处死大鼠并取肝脏。

1.4 肝微粒体的制备及体外肝微粒体体系的建立 大鼠断头处死，用生理盐水从肝门静脉冲洗肝脏至土黄色，取肝脏1 g用3 mL Tris-HCI缓冲液匀浆。按照文献[5]方法离心获得肝微粒体，所得肝微粒体用K2HPO4缓冲液重悬。肝微粒体悬液于-80℃保存。

体外肝微粒体体系的建立参照文献[6]进行，体系中cocktail探针底物氨苯砜、非那西丁浓度均为2 μg/mL，奥美拉唑、氯唑沙宗浓度均为4 μg/mL。反应1 h后加入CH2Cl2终止反应，并加入甲硝唑内标溶液，涡旋混合，5 000 r/min离心5 min，取有机相氮气吹干，用甲醇复溶后进样。

1.5 高效液相色谱法（HPLC）条件及方法学考察 Waters600E配自动进样系统（Waters 2487紫外检测器），Agilent TC-C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）色谱柱，柱温25℃，流动相为乙腈∶水（醋酸铵）=32∶68，流速1．0 mL/min，检测波长282 nm。

以探针峰面积与内标峰面积比值为纵坐标与探针浓度为横坐标做标准曲线。取8．0、2．0、0．5 μg/mL 3个探针混合浓度，每个浓度5个样计算其回收率，每一浓度测5次计算日内精密度，每一浓度连续测定3 d计算日间精密度。

1.6 统计学方法 数据统计采用SPSS17．5软件，组间比较采用单因素方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 方法学考察结果 肝微粒体本身对所选探针及内标并无明显干扰，各个底物和内标均可以较好的分离，保留时间也较为适中，见图1。

图1 典型肝微粒体HPLC图Fig.1 Typical HPLC chromatogram of liver microsome

1）氨苯砜的标准曲线的直线回归方程为Y^= 0．841 5X+0．023 1，相关系数r=0．997 7，线性范围0．5～8．0 μg/mL，回收率在94．06%～101．39%，日内精密度RSD为2．94%～5．16%，日间精密度RSD为4．76%～9．43%。

2）非那西丁的标准曲线的直线回归方程为Y^= 0．5037X+0．1288，相关系数r=0．996 8，线性范围0．5～8．0 μg/mL，回收率在93．35%～103．46%，日内精密度RSD为3．68%～7．04%，日间精密度RSD为4．37%～8．63%。

3）奥美拉唑的标准曲线的直线回归方程为Y^= 0．8130X+0．2144，相关系数r=0．999 3，线性范围0．5～8．0 μg/mL，回收率在94．76%～99．26%，日内精密度RSD为2．45%～8．76%，日间精密度RSD为5．88%～9．81%。

2.2 壮骨关节丸及2个新工艺对P450的影响 cocktail探针在体外肝微粒体系统中代谢1 h后，对照组大鼠肝微粒体代谢探针中氯唑沙宗29．6%、非那西丁37．0%、氨苯砜20．7%、奥美拉唑32．6%。壮骨关节丸及其2个新工艺的给药组大鼠肝微粒体体外对氯唑沙宗的代谢能力降低，剩余氯唑沙宗浓度显著升高，与对照组相比壮骨关节丸组代谢减少36．1%、壮骨1号方组代谢减少55．2%、壮骨2号方组代谢减少42．1%，而非那西丁、氨苯砜、奥美拉唑浓度与对照组之间比较，差异无统计学意义。

图2 肝微粒体系统中代谢1 h后Cocktail探针的浓度Fig.2 Concentrations of Cocktail probes in liver microsomes system after metabolism for 1 h

3 讨论

cocktail探针中氯唑沙宗、非那西丁、氨苯砜、奥美拉唑分别为CYP2E1、CYP1A2、CYP3A及CYP2C19的特异性底物[7]，考察cocktail探针在大鼠肝微粒体系统中的代谢可以反应出4个P450酶亚型的活性，虽然研究认为大鼠的多探针实验与单探针实验数据存在一定差异[8]，但这并不影响判断药物对P450的诱导和抑制作用，同时可以避免体内影响因素较多的问题[9]。实验选择在连续给药7 d，末次给药后24 h取肝脏制备肝微粒体，可以考察长期用药后细胞色素P450活性的变化而且让受试药本身尽量代谢掉，从而减少对实验的干扰。实验结果提示，新工艺并未改变壮骨关节丸对细胞色素P450的影响，壮骨关节丸及壮骨1号方、壮骨2号方连续用药抑制了大鼠CYP2E1的活性，而对CYP1A2、CYP3A及CYP2C19无显著影响。

壮骨关节丸含有熟地黄、乳香、没药、补骨脂、淫羊藿、独活、骨碎补、桑寄生、木香、续断、狗脊、鸡血藤共12味药材，有研究认为淫羊藿苷可以抑制CYP2E1而诱导CYP1A1和CYP3A[10]，课题组前期研究表明，乳香、没药可以诱导CYP1A2、CYP2E1活性增强而对CYP3A无显著影响[6]，研究表明补骨脂对P450也有一定影响，但报道的结果并不完全一致，体外肝微粒体研究[11]表明补骨脂素和异补骨脂素对CYP1A2和CYP2D6有抑制作用而对CYP3A有诱导作用，而对HepG2细胞的研究[12]中CYP1A1和CYP3A4均呈现抑制作用。而且更多的药材并无P450相关的研究报道，目前很难界定壮骨关节丸对CYP2E1的抑制到底是哪些药材的综合结果。

CYP2E1约占P450总量的7%，目前的研究证实CYP2E1的底物多达75种，其中大部分为前致癌物和前毒物，少部分为药物。骨性关节炎为中老年人多发病，可能会联合使用的降脂药、降压药大多数不经过CYP2E1代谢，如辛伐他丁、洛伐他丁、阿托伐他汀、硝苯地平、非洛地平主要由CYP3A4代谢，而氟伐他丁主要经CYP2C9代谢[11]，而壮骨关节丸及其新工艺对CYP3A活性并无显著影响，CYP2E1主要负责异烟肼、对乙酰氨基酚和氯唑沙宗等临床药物的代谢，同时CYP2E1可活化四氯化碳、硫代乙酰胺等肝毒物和苯、苯乙烯、氯乙烯和三氯乙烯等前致癌物[12]，这些药物或毒性前成分是经过CYP2E1代谢而生成的代谢产物有毒性，而壮骨关节丸对CYP2E1显示为抑制作用并不会导致这些药物或毒性前成分的毒性增强，提示壮骨关节丸与这些药物同时使用不会导致毒性增强，联合用药是较为安全的。

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Influence of Zhuanggu Guanjie pill on liver microsome cytochrome P450 in rats

ZHOU Kun1,ZHU Tao-tao1,ZHANG Yue1,DAI Zhi2
（1.Key Laboratory of Traditional Chinese Medical Formulae,Ministry of Education,Institute of Traditional Chinese Medicine, Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China;2.R&D Center of Sanjiu Medical&Pharmacutical Co.Ltd,Shenzhen 518110,China）

[Objective]To investigate the influence of Zhuanggu Guanjie pill(ZGGJ)on liver microsome cytochrome P450 in rats. [Methods]Rats were administered intragastrically with ZGGJ and their two new technologic products（crude drug,2.1 g/kg）once a day for 7 days.The 24 hours after the last administration,rats were sacrificed and liver microsomes were prepared by calcium sedimentation. CYP3A,CYP1A2,CYP2C19,CYP2E1 activity of liver microsomes,including dapsone,phenacetin,omeprazole and chlorzoxazone were detected by cocktail probe in vitro.[Results]Cocktail probes were metabolized in liver microsomes system for 1 h.Chlorzoxazone concentration of administrated groups,including ZGGJ and their two new technologic products groups was significantly higher than control group.There was no significant difference of omeprazole,phenacetin,dapsone concentrations between administrated groups and the control group.[Conclusion]ZGGJ can inhibit CYP2E1 activity,but has no significant effect on CYP1A2,CYP3A and CYP2C19 in rats.

Zhuanggu Guanjie pill;cytochrome P450;CYP1A2;CYP2E1;CYP2C19;CYP3A

R285.5

A

1672-1519（2014）11-0690-03

2014-05-23）

（本文编辑：高 杉，马晓辉）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.11.14

国家重大新药创制专项（2011ZX09201-201-21）。

周 昆（1978-），男，助理研究员，主要从事中药毒性及减毒研究。