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(青岛大学附属医院泌尿外科，山东 青岛 266071)

在世界范围内，膀胱癌发病率居恶性肿瘤的第9位[1]。在我国，男性膀胱癌发病率居全身肿瘤的第8位，女性为第12位[2]。膀胱癌中移行细胞癌最多见，其发病率和复发率均较高，受到广泛关注[3]。转移是决定浸润性膀胱癌的侵袭性及临床预后最重要的临床病理特征，30%的浸润性膀胱癌病人确诊时镜下已发现转移，超过90%的病人最终死于肿瘤转移。膀胱肿瘤又为异质性肿瘤，TNM系统不能完全评价肿瘤的转移潜能。肿瘤间质是肿瘤不可或缺的组成部分，其对肿瘤的恶性程度、转移潜能的调控机制一直是肿瘤学研究的热点。本研究以膀胱肿

瘤间质蛋白作为研究对象，以放射性核素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ法)获取肿瘤蛋白表达谱，并与尿液的蛋白质表达谱进行比对，探讨从尿液中发现反映膀胱癌恶性转移潜能的生物标记组的可能性。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

按照“知情同意”原则收集高、中、低转移潜能浸润性膀胱癌标本各10例。病人因浸润性膀胱癌在我院治疗，在泌尿外科行全膀胱切除术。术前均未进行化疗或放射治疗。术后10 min内取肿瘤组织，无菌PBS冲洗后，液氮冷冻保存备用。标本经两名副高级以上病理学专家检查确诊，并根据回顾性分析中的主流统计学模型预测指数(PI)收集标本，根 据PI的整体分布将病人的转移风险分为3组。

1.2 激光捕获显微切割技术(LCM)切割肿瘤组织

LCM使用PixCell Ⅱlaser capture microdissection system 和CapSure LCM Macrocaps (Arcturus Engineering公司)，按照文献描述步骤操作。根据光镜下样本情况及获得最佳捕获效率设定仪器参数:Pulse Duratio 2.0 ms，Beam-Diameter 15 μm，Beam Power 70 mW。每例标本捕获间质细胞25 shootings，显微镜下检查切割所获得的细胞群均具有98%的同源性。

1.3 胰酶蛋白酶酶解蛋白

酶解蛋白质混合物及二维液相色谱分离多肽混合物，经LCM技术处理后放入沉淀溶液中,-20 ℃至少12 h。以含体积分数1.00的丙酮及体积分数0.70的乙醇冲洗片状沉淀物，采用Bio-Rad protein assay kit检测可溶性蛋白质浓度。二硫苏糖醇浓缩可溶性蛋白质200 μg，最终浓度为20 mmol/L，然后经40 mmol/L碘乙酰胺烷基化。Microcon-10超滤去除甲苯胺蓝并且脱盐后，蛋白质混合物中加入测序级胰蛋白酶(蛋白质混合物∶测序级胰蛋白酶=1∶30)37 ℃过夜。

1.4 肽段标记

各组样品分别取100 μg，按照试剂盒iTRAQ Reagent-4plex Multiplex Kit(AB SCIEX)说明书进行标记。用iTRAQ溶解缓冲液溶解；随后分别在iTRAQ试剂115、116和117内各加入60 μL无水乙醇,用处理后的iTRAQ试剂115、116和117分别标记高危、中危、低危肽段混合物，室温条件下反应1 h后，把4组标记样品混合，加入10倍体积的SCX上样缓冲液。

1.5 SCX分级

取标记后的所有肽段混合，应用仪器AKTA Purifier 100(GE Healthcare)进行SCX预分级。收集穿流及洗脱fraction约30份，根据SCX色谱图合并成10份，冻干后C18 Cartridge脱盐。

1.6 毛细管高效液相色谱

每份样品采用纳升流速HPLC液相系统Easy nLC进行分离。

1.7 质谱鉴定

每份样品经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪(Thermo Finnigan)进行质谱分析，按照机器操作步骤说明进行操作。多肽和多肽碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描后采集10个碎片图谱。采用美国Finnigan公司提供的SEQUEST软件搜索碰撞诱导裂解后的串联质谱图。搜索使用的数据库为IPI human蛋白库。

1.8 基因本体论(GO)分析

对我们研究的差异表达蛋白谱进行深入分析，GO蛋白软件用于GO浓集-缺失表达分析获得的生物学数据，对于浓缩分析，我们需要一个测试数据集和一个GO注释的包含完整的人类蛋白质组的参考集。按照GO网页上的说明，从EBI GOA 80.0提取出的有关GO注释创造出了自定义的GO的参考集。

1.9 统计方法

统计分析采用SPSS version 16.0软件，应用卡方检验进行比较，以P<0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 蛋白质鉴定

各组样本中分别鉴定出蛋白991/964、957/1 022、1 086/979个。为了揭示间质细胞的遗传特点并降低数据的复杂性，我们只分析3组样本中共表达的943个蛋白。差异表达蛋白中的最大和最小相对分子质量分别为5 630和629 090，等电位(PI)分布范围为3.67～11.36。

2.2 蛋白质浓集-缺失表达分析

在943个蛋白质中具有生物学途径、细胞成分注解的蛋白质分别为760、804个。通过与国际蛋白质索引(IPI)的完整列表进行对比，生物学途径中浓集-缺失的分支术语为55/11，细胞成分中浓集-缺失的分支术语为43/8。

3 讨 论

膀胱肿瘤转移潜能存在异质性，获得体现肿瘤转移潜能的细胞纯系是进行本研究的关键步骤，为达到此目的，我们实验第一步采取了LCM技术，并获得足量蛋白进行后续iTRAQ蛋白质组学分析。LCM联合iTRAQ技术，最终我们获得了肿瘤间质中943个差异表达蛋白，蛋白质中具有生物学途径、细胞成分注解的蛋白质分别为760、804个。其中的部分蛋白已经被报道与膀胱癌转移潜能密切相关。例如，FSCN1被证实在浸润性膀胱癌组织标本及相应尿液标本中100%过度表达[4]；在高级别及多发膀胱肿瘤组织中HMOX1 mRNA的表达显著高于低级别及单发者，其可作为预测肿瘤复发及转移的生物标记[5]；应用免疫组织化学技术检测膀胱肿瘤组织中蛋白表达情况，ANXA1表达显著增加，其表达水平与膀胱肿瘤的预后密切相关[6]。

既往研究中已经证实,肿瘤间质在肿瘤发生和发展及转移过程中发挥重要作用。人原发性结直肠肿瘤和间质细胞具有多种异质性分泌物，其通过ELR+CXC趋化因子高度分泌，作用于CXCR1和CXCR2，从而影响肿瘤的生长和恶化[7]。葡萄膜黑色素瘤5年病死率高达30%，死因是由于肝脏转移,而肿瘤间质高表达PEDF，可抑制小鼠模型肝转移的进展[8]。近期研究结果显示，在结直肠癌的远处转移中高表达转化生长因子-β诱导的肿瘤基质成纤维细胞分泌白细胞介素11是一个必要的先决条件[9]。本研究通过检测高、中、低浸润性膀胱癌间质中差异表达的蛋白质来判定肿瘤病人转移的风险，为肿瘤的综合治疗提供帮助。

细胞增殖、分化、黏附等相关蛋白的研究一直是肿瘤研究的热点，很多蛋白已经被验证同肿瘤的发生发展密切相关。本研究结果提示，此类蛋白的表达差异决定了肿瘤的转移潜能，并可以用于评判肿瘤的转移风险。生物学途径中，以细胞增殖、细胞分化、细胞黏附及细胞行为为例，对比已发表文献，发现这些蛋白的浓集表达符合恶性肿瘤的生物学特点。在细胞增殖过程中，PRDX1在胆囊癌组织中表达异常，与胆囊癌进展及预后关系密切[10]；在前列腺癌组织中，PEDF通过直接诱导单核细胞或巨噬细胞迁移和分化成m1型细胞而发挥抗肿瘤作用[11]；KHDR1在鳞状细胞癌组织中高度上调，其在膀胱癌的进展中可能发挥重要作用[12]。欧洲肿瘤实验中心的癌症临床试验结果显示，在33例肿瘤病人中检测到AINX的表达，其可影响间变性少突胶质细胞瘤化疗效果并可作为独立的预后因素[13]；CALR表达水平的变化可能会影响膀胱癌在体外和体内的进展。以RNA和基质金属蛋白酶2、9为检测目标，以提高常规尿液细胞学诊断效能的研究中，MMP9预测膀胱肿瘤尿细胞学灵敏度为90%[14]。这些蛋白密切参与了各类肿瘤的生物学过程，在肿瘤的细胞增殖、分化、黏附过程中发挥作用，在一定程度决定了肿瘤的转移风险。

根据GO细胞组分浓集-缺失分析的定义，浓集的特定蛋白功能活跃，并且该成分的蛋白组更容易通过生物流体研究呈现，更可能被确认为生物标记物。在溶酶体术语中，已经证实乳癌、肺癌和脑癌的浸润转移过程中各种溶酶体蛋白高度表达，超过正常水平；核内体蛋白CATB在肿瘤细胞侵犯质膜的过程中可降解层粘连蛋白和基底膜成分，从而促进肿瘤的浸润[15]。我们研究的结果表明，特定蛋白在肿瘤的浸润过程中功能活跃，可用来作为生物标记。

总之，LCM联合iTRAQ法分析不同转移潜能浸润性膀胱癌间质蛋白的表达谱特征，结果可靠、有效。细胞的生物学途径和亚细胞结构决定肿瘤转移潜能，并可以成为潜在的可以从尿液中检出的生物学标记物。

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