汪运舟 刘贤勇 索 勋

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)

兔艾美耳球虫(Rabbit coccidia)，是一类专性寄生于兔消化系统并引起严重疾病的寄生原虫。兔球虫共包含11个虫种，以其寄生位点的不同，分为肝球虫和肠球虫两类：前者指寄生于胆管上皮细胞的斯氏艾美耳球虫，而后者包括寄生于肠道上皮细胞的肠艾美耳球虫Eimeriaintestinalis、黄艾美耳球虫E.flavescens、大型艾美耳球虫E.magna、中型艾美耳球虫E.media、无残艾美耳球虫E.irresidua、梨形艾美耳球虫E.piriformis、穿孔艾美耳球虫E.perforans、小型艾美耳球虫E.exigua、维氏艾美耳球虫E.vejdovskyi、盲肠艾美耳球虫E.coecicola等另外10种兔球虫。兔球虫在各种类型的兔场中均有较高的感染率，其中肠、黄、大型、中型、斯氏等几个虫种具有较强的致病性，能够引发家兔产生严重的球虫病。兔群中以刚断奶至3月龄的仔兔最为易感，发病死亡率高达60%，耐受个体生长迟缓，饲料转化率低；成年兔则可常年带虫，向环境中长期排放卵囊。因此球虫病的存在严重影响经济效益，大大制约了养兔业的发展(景发, 2011)。普遍认为，疫苗免疫是球虫病防治最佳手段，上世纪50年代以来，鸡球虫病疫苗已经在养鸡业中广泛应用并取得了巨大成功(Chapmanetal., 2002)。相比而言，兔球虫病疫苗的开发则大大滞后，尚无疫苗问世。已有的研究成果已经证明兔球虫具有良好的免疫原性，能够激发宿主产生良好的保护性免疫应答，有着巨大的疫苗开发潜力。因此本文对近年来家兔抗球虫免疫以及疫苗开发的研究进行综述，为今后的兔球虫病研究以及疫苗开发提供相应的参考。

1 家兔抗球虫免疫

1.1 兔球虫的免疫原性研究

鸡和小鼠的研究表明，艾美耳属球虫的感染能够激发动物机体产生良好的保护性免疫应答，具有良好免疫原性(Dallouletal., 2006)；同理，感染过球虫的家兔对同种球虫的再次感染如有较强抵抗力，表明该兔球虫同样具备良好免疫原性。目前对于兔球虫免疫原性的评价主要集中在：免疫后能否减轻再次感染的临床症状，能否保证体重增长不受影响，以及能否降低卵囊排出量这3个方面。因此，研究人员基于此3个方面对兔球虫各个虫种开展大量的研究。

研究表明肠艾美耳球虫具有强免疫原性。Coudert 等(1993)以6周龄的无球虫新西兰白兔为实验动物，分别接种6、6×102、6×103个肠艾美耳球虫卵囊进行免疫，14 d后进行1×104个卵囊的攻毒。结果表明，感染6个卵囊后，家兔即可建立一定的免疫力，而感染600个卵囊则能够对二次感染提供完全的免疫保护。Shi 等(2014)人对肠艾美耳球虫浙江分离株进了免疫原性鉴定，结果5×102个卵囊所激发起的免疫应答能够完全消除1×105个卵囊攻毒所造成的临床病变，卵囊排出量降低70%，较欧洲分离株的免疫原性稍弱。

Niilo(1967)模仿田间感染规律，用大型艾美耳球虫E.magna对家兔进行首免5×102个卵囊，以5 d为间隔，连续7次，每次剂量增倍的方式免疫，最后一次免疫后12 d攻毒，结果显示，免疫组可对1×106个卵囊的攻毒产生较好的免疫保护，卵囊排出量相较对照不免疫攻毒组降低3 000倍。Licois等(1995)用2 500个大型艾美耳球虫欧洲分离株接种6周龄无球虫新西兰白兔，在14 d后进行1×104个卵囊的攻毒，结果显示其对免疫兔的体重增长不再造成任何影响，证明了免疫能够建立坚实保护。

Norton(1979)对无残艾美耳球虫E.irresidua进行了免疫原性研究，在分别接种1×102、1×103、104个卵囊后21 d，以1×106个卵囊进行攻毒。结果显示，无残艾美耳球虫同样具有良好的免疫原性，1×102个卵囊的免疫即可将攻毒后卵囊排出降低10倍以上，且各个免疫组均未在攻毒后产生临床症状。

黄艾美耳球虫E.flavescens被普遍认为是免疫原性较差的虫种，研究表明，只有使用致病剂量的1×104个卵囊进行免疫，才能对28 d后相同剂量的卵囊攻毒产生较好的免疫保护，而其他低剂量的免疫都不能有效抑制攻毒后的体增重降低和卵囊排出(Norton, 1979)。张龙现(1994)的研究也表明只有进行加倍递增卵囊剂量、多次接种的涓滴免疫策略，才能减轻攻毒后的临床症状和和卵囊排出量，而进行高剂量一次或者低剂量多次的方法都不能有效建立免疫保护。

Pakandl等(2009)将11个种的兔球虫免疫原性进行划分，其中肠艾美耳球虫具有强免疫原性，中型艾美耳球虫、大型艾美耳球虫和无残艾美耳球虫具有中等免疫原性，而黄艾美耳球虫和梨形艾美耳球虫则被认为免疫原性较差，但是其并未给出界定免疫原性强弱的明确标准。

有关不同虫种免疫原性的描述不同研究报道间存在一定差异，可能由以下原因造成：(1)不同试验所用球虫分离株不同。由于地理分布差异，各地分离株在生物学特性上存在较大差异，如肠艾美耳球虫(Shietal., 2014)。(2)实验动物的差异。不同试验使用的家兔在日龄和免疫背景上有所不同，而只有使用未感染过球虫的动物才能正确对免疫原性进行评估。(3)试验条件的差异。饲料成分、管理水平的差异都会使得出的结论存在差异，因此应将此类因素考虑在内。(4)虫种鉴定出现的问题(不同虫种混为一种)。崔平(2012)发现的一株新的兔艾美耳球虫的形态学特征与大型艾美耳球虫相近似，但生物学特性有着较大差异，因此研究前应对虫种进行种的鉴定。

1.2 家兔抗球虫免疫应答特征

自上世纪20年代发现抗球虫免疫之后，对于其机理的研究就不断深入。相较于禽类和鼠球虫的研究，兔球虫所激发免疫应答的研究则属于起步阶段。即便如此，研究人员也获得了一些较为重要的研究成果。

一般认为肠道黏膜免疫系统介导的局部免疫应答在抗球虫免疫中起着重要的作用。兔的肠道粘膜免疫系统，包括肠道相关淋巴组织(Gut associated lymphoid tissue, GALT)和肠系膜淋巴结(Mesenteric lymph nodes, MLN)。GALT主要包括盲肠隐突(Vermiform appendix)、圆小囊(Sacculus rotundus)、Peyer氏结(Peyer’s patches, PPs)、肠上皮淋巴细胞(Intestinal intraepithelial lymphocytes, IELs)和固有层淋巴细胞(Lamina propria lymphocytes，LPLs)。其中Peyer氏结表面有着丰富的M细胞(Microfold cell)能够有效转运肠道中的抗原物质，而其下方所含有的丰富的树突状细胞等抗原递呈细胞，能够有效地将抗原递呈给免疫系统；IELs和LPLs中则含有大量的CD4+和CD8+细胞，介导随后的细胞免疫应答。兔的盲肠隐突和圆小囊被认为和禽类法氏囊有着相似的结构和功能，与兔抗体多样性的产生有关，因此在体液免疫应答中发挥重要作用(Pakandl, 2009)。

1.2.1 兔球虫激发的细胞免疫应答研究: 大量研究表明，细胞免疫应答在介导抗球虫免疫中起着最为重要的作用。Renaux等(2003)研究了肠艾美耳球虫感染后细胞免疫应答的产生。研究表明，在感染肠艾美耳球虫14 d后，肠道淋巴细胞的增值能力出现明显的提高，而参与系统免疫应答的脾脏淋巴细胞的增值能力则没有出现明显变化；肠上皮和肠系膜淋巴结中的CD8+T细胞比例和数量上升，表明这群细胞可能在抗兔球虫免疫中发挥重要作用。Pakandl等(2008a)比较了肠艾美耳球虫和黄艾美耳球虫的首次感染后激发免疫应答的特征。结果显示，两种球虫虽然免疫原性相差较大，但是都能激发良好的黏膜免疫应答，且均以细胞免疫应答为主；但是免疫原性较差的黄艾美耳球虫在其寄生位点——盲肠，激发的CD8+T细胞水平不高，因此推断这可能造成家兔对该种球虫的再次感染抵抗力差的原因。遗憾的是，以上对于家兔抗球虫免疫的分子机制研究仅限于初次感染，而对于再次感染后的应答机制则未能研究阐述；而且研究未分析抗原刺激后特异性CD4+/CD8+细胞的应答特征，没有验证这些反应是否与保护性应答存在联系。综上所述，兔抗球虫免疫主要依赖于肠道局部免疫系统，而其中的CD8+T细胞发挥着重要的作用。

1.2.2 兔球虫激发的体液免疫应答研究: 球虫感染后能够激发宿主产生良好的体液免疫应答，诱导产生大量的抗体，如IgM、IgG和IgA，这些抗体的产生，能够阻断子孢子的入侵，参与抗原的交叉递呈、补体反应等诸多免疫反应(Wallach, 2010)。

斯氏艾美耳球虫感染家兔后，21 d能检测到明显的体液免疫应答，其能够诱导产生针对卵囊抗原和粪便抗原的特异性抗体(Rose, 1959)。黄艾美耳球虫感染同样可以诱导良好的体液免疫应答，感染后15 d可以检测出血清抗体，25 d IgG的含量达到最高峰；再次感染，即大剂量攻虫之后抗体水平能够迅速上升，且维持时间较长；基于黄艾美耳球虫感染建立的ELISA检测结果表明球虫子孢子抗原可能是激发体液免疫的优势抗原(张龙现, 1994)。家兔在初次感染2 000个肠艾美耳球虫后，虽然能够激发起体液免疫应答，但是抗体滴度较低，只有经过3次免疫后，才能获得较高的抗体滴度；遗憾的是其并未进行试验来验证这种高水平抗体在抗球虫免疫中的作用和维持水平(Renauxetal., 2003)。目前普遍认为，体液免疫应答在抗球虫免疫中仅起辅助作用，但是兔球虫感染后抗体水平是否与免疫保护的建立有相关性还无定论。张龙现(1994)的研究表明，黄艾美耳球虫感染后激发的抗体水平与后期免疫保护没有相关性；但也有研究表明，斯氏艾美耳球虫激发的抗体水平高低能够反应保护性免疫应答反应的强弱(张龙现，1999)。

目前对于兔抗球虫体液免疫应答仅限于抗体产生规律的研究，并未对其发挥的作用进行深入分析，后期研究应当利用被动免疫等手段去具体验证抗体所发挥的功能。

1.2.3 日龄对家兔抗球虫免疫应答的影响研究: 家兔属哺乳动物，消化器官和免疫器官在其出生后需要经过一定时间的发育才能最终成熟(Mage, 1998)，因此断奶前的仔兔对球虫并不易感，且免疫后也无法建立良好的免疫保护。Pakandl等(2008b)研究了不同日龄未断奶仔兔感染肠艾美耳球虫和黄艾美耳球虫后免疫应答的差异，结果显示，家兔只有在25日龄之后感染球虫，才能有效激发良好的细胞和体液免疫应答；Drouet-Viard(1997)对大型艾美耳球虫的研究也发现，对25日龄前的仔兔进行免疫获得的保护效果并不理想。分析原因可能是断奶前仔兔消化系统中缺乏子孢子脱囊的胆酸盐成分，导致了其对球虫易感性差，球虫在宿主体内繁殖量少，给免疫系统提供的抗原量不足；其次免疫系统发育不完善，因此难以产生良好的免疫应答。选择正确的日龄进行免疫在疫苗应用时十分重要，有关日龄影响免疫保护建立的原因和机理有待进一步研究。

综上所述，针对兔球虫的免疫研究虽然已经起步，但是研究尚浅，缺乏机理性研究；仅有几篇关于分子机制的文献报道后，并无研究跟进，导致了相关领域的研究存在较大的空白，有待于研究人员进一步研究探索。

2 兔球虫病疫苗的研发

目前国际公认最好的球虫病防控策略是利用活卵囊疫苗进行预防，动物经口摄入少量球虫卵囊后，其在动物体内进行繁殖排出体外，而动物通过再次摄入自身排出的已经孢子化的卵囊形成再次免疫；经过2～3次的反复感染后，动物机体即可建立针对球虫的坚强免疫保护。因此活虫疫苗一直是兔球虫病疫苗研发的最佳方向。

2.1 活卵囊疫苗的研发

2.1.1 兔球虫早熟株的选育: 动物在摄入活卵囊疫苗后会对自身的生产性能造成一定影响，因此使用弱毒虫株作为疫苗组分是最佳的选择。Jeffers(1975)利用早熟压力筛选的方法获得裂殖生殖代次减少的鸡柔嫩艾美耳球虫早熟株，证明了其在保留免疫原性的同时致病性下降，这为兔球虫病弱毒活疫苗的研发开拓了思路。目前已有6个虫种的兔球虫早熟虫株被成功选育。

Licois等(1990)经过6代早熟压力选择，成功获得了肠艾美耳球虫的早熟系，使其潜在期缩短了71 h，系世界首次获得的兔球虫早熟株；其同时证明了该早熟株毒力相较原始株有了明显的降低；此后Licois等(1994)又经过12代的选育，获得了潜在期缩短了36 h的中型艾美耳球虫E.media的早熟株； 1995年Licois等又成功选育了第3个兔球虫——大型艾美耳球虫的早熟株，与原始株相比，潜在期缩短了46 h，致病性显著降低，繁殖力降低了500倍；Pakandl(2005)则通过连续18代的选育，获得了黄艾美耳球虫的早熟株，潜在期缩短了60 h；第5个被成功选育的是梨形艾美耳球虫，经过12代选育，潜在期从194 h缩短到170 h(Pakandletal., 2006)；另有报道称Coudert (1995)成功筛选出了盲肠艾美耳球虫的早熟株，但选育代次和潜在期缩短时间不详(Pakandl, 2009)。目前我国也开展了兔球虫早熟株的选育，方素芳(2012)对大型艾美耳球张家口株进行了成功的早熟选育，潜在期与Licois(1995)的研究结果相近。

兔球虫早熟株在生物学特性的变化上均呈现了一定的相似性。(1)虫株的毒力出现了明显下降，1×103个大型艾美耳球虫和中型艾美耳球虫都会对仔兔体重增长造成明显影响，而相同剂量早熟株感染的仔兔与对照组生长则完全相同(Licoisetal., 1991, Licoisetal., 1994)。(2)繁殖力大大下降，大型艾美耳球虫的早熟株繁殖能力降低了500倍，这种繁殖力的降低可能是由于裂殖生殖代次的减少而造成，兔球虫早熟株普遍缺少了其生活史中第3代或第4代裂殖生殖。(3)形态学特征发生改变，肠艾美耳球虫子孢子折光体消失，取而代之的则是在孢子囊中出现了一个大的折光体(Licois, 1993)，大型艾美耳球虫和中型艾美耳球虫同样也是由孢子囊的折光体取代了子孢子折光体。但是这种改变并不是普遍现象，黄艾美耳球虫原始株和早熟株没有明显的形态学差异(Pakandletal., 2003)。

2.1.2 兔球虫早熟系疫苗的初步研究: 兔球虫早熟系的成功选育为兔球虫病疫苗开发提供了巨大的帮助。Licois等(1995)实验证明，免疫2 500个早大型艾美耳球虫早熟株卵囊，能够对致病剂量的卵囊攻毒起到良好的保护；同样，1994年Licois等通过接种1 000个中型艾美耳球虫早熟株，激发了宿主产生良好的免疫保护，且免疫不会对家兔的体重造成任何影响。

Drouet-viard等(1997)研究了大型艾美耳早熟系虫株的最适免疫剂量和免疫日龄，认为在仔兔25日龄时免疫3 500个大型艾美耳球虫早熟株卵囊，能够对1×104个强毒株卵囊的攻毒产生免疫保护，且不会对体重造成影响，这种有效免疫保护保护建立仅需要9 d；Drouet-viard等(1997)同时也验证了该早熟珠喷雾免疫的实用有效性，结果证明对于25日龄的仔兔使用4×104个早熟株卵囊进行免疫可以有效的建立免疫保护，抵抗10 d后的攻毒。其结果为今后兔球虫病疫苗的剂量选择和免疫方法提供了重要依据。Akpo等(2012)进行了大型艾美耳球虫和中型艾美耳球虫混合免疫攻毒试验，证明了两者进行同时免疫后，能够建立有效的免疫保护，彼此互不干扰，表明兔球虫病多联疫苗开发的可行性。虽然早熟活卵囊疫苗的研究尚处于实验室研究阶段，但是成功的免疫保护结果都有力的支持了其应用的可行性。

2.1.3 兔球虫其他致弱毒株的尝试: γ射线照射的方法曾经被用于致弱斯氏艾美耳球虫，结果显示通过照射获得了毒力减弱的虫株，但是其免疫原性也相对减弱(Pakandl, 2009)；廖党金(2005)等利用化学试剂致弱的方法，同样获得了致弱的斯氏艾美耳球虫弱毒株，且该致弱毒株能够对强毒株的感染提供免疫保护。照射γ射线和化学致弱的理论依据是杀死部分卵囊还是使虫种本身毒力减弱尚不明确，因此该方法获得弱毒株免疫研究仅停留在理论研究阶段。

2.2 兔球虫亚单位疫苗的探索研究

寻找球虫自身优势性保护抗原，是研究抗球虫免疫应答机制和开发亚单位疫苗的有效手段。Johnson等(1989)发现了绵羊棘球蚴绦虫一个免疫优势抗原Eg95，并通过该抗原的免疫建立了完全的免疫保护，证明了该研究方向的可行性。同时相比于活卵囊疫苗，亚单位疫苗还有着生产成本低，安全性好，操作简便的优势，因此也是当前球虫病疫苗研究的热点之一。

Hanada等(2003)从斯氏艾美耳球虫感染兔的胆汁中获得可溶性抗原，该抗原免疫后能够有效降低攻毒后卵囊的排出量，使肝脏功能指标趋于正常，病理学检测也表明胆管周围的淋巴细胞和中性粒细胞数量增加，虫体数量减少。随后研究发现，胆汁中能够激发高水平体液免疫应答的可溶性抗原主要由裂殖生殖阶段的虫体所分泌，其蛋白大小约为47 kDa。Omata等(2001)利用胆汁抗原对仔兔进行免疫，同时以霍乱毒素B为佐剂，能够激发高水平的IgG和分泌型IgA产生；利用免疫印迹检测方法证明了抗原蛋白主要集中在32、37、49 kDa，由裂殖子阶段分泌。Abdel等(2005)同样利用免疫印迹的方法检测了斯氏艾美耳球虫感染后粪便抗原的分布，证明了22和155 kDa处的蛋白能够与高免血清发生良好的反应，推断此处的蛋白可能激发宿主良好的抗球虫免疫。以上研究并未对这些蛋白可能的序列进行质谱分析，未发现特定的兔球虫抗原，因此离实践应用还有相当长的一段距离。

上述研究表明，利用兔球虫的免疫优势抗原进行免疫是可行的，但是目前的研究尚不深入，随着蛋白组学技术和转录组学技术的不断发展，更多先进技术应当被应用于兔球虫免疫优势抗原的寻找中来。

综上所述，兔球虫病疫苗的开发无疑是可行的，但是在获得一系列的研究结果后，进一步的开发利用却趋于停滞，近年来关于兔球虫疫苗的相关研究基本不见报道，这种现象可能是由于经济、技术以及重视程度等多种原因导致的，但是由于兔产业的不断发展、日趋严峻的疫病防控前景和公共卫生安全对于药物的严格限制，兔球虫病疫苗仍然是生产中十分迫切需要的。

3 兔球虫病疫苗开发展望

鉴于兔球虫病的巨大危害，养兔生产亟需兔球虫病疫苗的研发和使用。虽然鸡球虫病疫苗已经投入使用超过半个世纪，且多个种的兔球虫早熟株也已成功选育，但是仍未有商品化的球虫病疫苗被开发利用，因此需要兔球虫研究人员继续不懈努力，开发安全有效的兔球虫病疫苗。

通过总结前人的研究经验，在此提出一些进行兔球虫病疫苗开发中应当注意的问题：(1)使用无球虫兔作为实验动物。球虫具有良好的免疫原性，试验前的卵囊感染很可能影响改变家兔的免疫状态，影响试验结果。(2)进行兔球虫早熟株的选育。兔球虫致病性较强，使用野毒活卵囊疫苗可能引发动物较大的疫苗反应，因此使用毒力减弱的卵囊进行免疫能够有效的降低这种影响。(3)对分离的虫株进行充分的生物学特性鉴定。由于不同地方分离株在致病性和免疫原性上有着较大差异，因此有必要对其进行准确的鉴定，才能够判断其是否具有作为疫苗组分的潜力。(4)虽然鸡球虫已有成熟的疫苗应用，但是由于家兔的生理特性与鸡相差较大，且兔球虫与鸡球虫生物学特性上有着一定不同，因此不能将鸡球虫病疫苗的成功经验直接套用。

长期以来，兔球虫病始终是严重影响养兔经济效益的消化道疾病之一，所以兔球虫病疫苗在兔业生产中需要迫切，相信随着研究的不断深入，兔球虫病疫苗的研发将不断克服困难，最终获得成功。