钱炜，Bipin Kumar Rai，袁即山，刘嫣方，顾韵，陈芹，谢军，张铭，马永明

（江苏大学附属人民医院1．耳鼻喉科，2．骨科，3．中心实验室，江苏镇江212002）

骨性关节炎关节软骨中线粒体酶表达的变化

钱炜1，Bipin Kumar Rai1，袁即山2，刘嫣方3，顾韵1，陈芹3，谢军2，张铭3，马永明1

（江苏大学附属人民医院1．耳鼻喉科，2．骨科，3．中心实验室，江苏镇江212002）

目的：探讨正常软骨与骨性关节炎软骨中线粒体几种关键酶的表达差异。方法：收集9例骨性关节炎患者及12例正常人的软骨，HE染色观察软骨的病理学表现。利用实时荧光定量聚合酶链式反应（RQ-PCR）和蛋白质印迹法检测两组软骨中NADH氧化还原酶辅酶1（NADH dehydrogenase ubiquinone 1 alpha subcomplex 1，NDUFA1）、琥珀酸脱氢酶复合体铁硫亚基（succinate dehydrogenase complex subunit B，SDHB）、细胞色素b（cytochrome b，Cytb）、细胞色素C氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）、V型H＋ATP酶（vacuolar-type H＋-ATPase，V-ATPase H）、苹果酸脱氢酶（cytosolic malate dehydrogenase，MDH）、短链羟烷基辅酶A脱氢酶（hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase，HADHSC）的表达情况。结果：骨性关节炎软骨中滑膜细胞增生，淋巴细胞浸润，严重者甚至出现斑片状钙化和纤维化。骨性关节炎软骨中NDUFA1与COX表达比正常软骨明显升高，差异有统计学意义（P＜0．05）；SDHB、Cytb、V-ATPase H表达比正常软骨明显下降，差异有统计学意义（P＜0．05）；MDH与HADHSC在两组中表达无明显差异。结论：线粒体关键酶的变化可能在骨性关节炎的发病中起重要作用。

骨性关节炎；软骨；线粒体；酶

近年来骨性关节炎（osteoarthritis，OA）已逐渐成为威胁健康的疾病。骨性关节炎具有明显的年龄相关性，随年龄增高患病风险明显增加。临床症状主要包括关节疼痛、捻发音、肿胀、僵硬、疲劳及功能受限。病理主要表现为基质的降解和细胞的死亡，从而逐渐破坏关节软骨的完整性［1－4］。骨性关节炎的致病因素至今仍不明确。研究显示线粒体可能在骨性关节炎的致病中起到重要的作用［5－6］。尽管如此，线粒体中某些重要酶的含量在骨性关节炎软骨中的变化仍不明确。本实验拟比较骨性关节炎患者软骨与正常软骨线粒体中NADH氧化还原酶辅酶1（NADH dehydrogenase ubiquinone 1 alpha subcomplex 1，NDUFA1）、琥珀酸脱氢酶复合体铁硫亚基（succinate dehydrogenase complex subunit B，SDHB）、细胞色素b（cytochrome b，Cytb）、细胞色素C氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）、V型H＋ATP酶（vacuolar-type H＋-ATPase，V-ATPase H）、苹果酸脱氢酶（cytosolic malate dehydrogenase，MDH）、短链羟烷基辅酶A脱氢酶（hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase，HADHSC）的表达差异，探寻线粒体在骨性关节炎致病中的意义。

1 对象和方法

1．1 研究对象

收集2013年6月至2014年2月共9例骨性关节炎患者及12例正常人的软骨。骨性关节炎软骨来自已确诊为骨性关节炎的患者（女6例，男3例，年龄55～74岁，中位69岁）进行关节置换术时切除的软骨。正常软骨来自车祸截肢或急性关节外伤关节软骨碎片脱落无法重新固定的患者（女8例，男4例，年龄42～82岁，中位66岁）。所有标本来自于江苏大学附属人民医院。本研究方案获本院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1．2 材料

兔抗人NDUFA1、SDHB抗体，HE染色试剂盒购买于武汉博士德生物工程有限公司。兔抗人COX抗体购买于Cell Signaling生物技术公司。兔抗人Cytb、V-ATPase H抗体，鼠抗人MDH、HADHSC、β-肌动蛋白抗体购买于Santa Cruz生物技术公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购买于碧云天生物技术研究所。

1．3 组织固定和HE染色

新鲜软骨用4%甲醛固定，石蜡包埋。蜡块切成4μm切片，37℃烘箱加热3 h，二甲苯脱蜡，苏木精和伊红染色。显微镜下进行病理观察。

1．4 RNA提取和逆转录反应

软骨切成小块之后加液氮研磨，加入TRIzol裂解。将2．0μg总RNA应用随机引物逆转录合成第一链cDNA，总体系40μL，含MMLV逆转录酶200U、dNTP（每种0．5 mmol／L）10 mmol／L、随机引物10μmol／L、RNA酶抑制剂80 U，37℃逆转录1 h，95℃5 min灭活，cDNA保存于－20℃备用。

1．5 RQ-PCR检测软骨线粒体酶mRNA的表达

25μL PCR反应体系包括10×PCR缓冲液、4 mmol／L MgCl2、0．2 mmol／L dNTP、引物0．4 mmol／L、20×EvaGreen（Hayward公司，美国）1．2μL、50× ROX 0．5μL、Taq DNA聚合酶（Fermentas）1 U及cDNA 2μL。反应在ABI 7300扩增仪上进行，以ABL作为内参照，2－ΔΔCT法计算目的基因表达的相对含量。引物序列见表1。

1．6 免疫印迹检测7种线粒体酶的表达

新鲜软骨立即冻存在－80℃直至使用。软骨切成小块之后加液氮研磨，加入RIPA裂解。软骨裂解液用BCA法测定蛋白浓度，调整蛋白量一致后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后转移至PVDF膜。5%BSA室温封闭1h，加入相应的一抗（NDU-FA1 1∶100，SDHB 1∶100，Cytb 1∶200，COX 1∶1 000，V-ATPase H 1∶200，MDH 1∶200，HADHSC 1∶200，β-肌动蛋白1∶5 000）4℃过夜。TBST洗膜之后加入HRP标记的相应二抗，ECL显色液化学发光检测。条带用LAND-1D进行灰度扫描。

1．7 统计学分析

应用GraphPad Prism 5软件进行统计分析，所有实验至少重复3次，结果用±s表示。两组间比较采用t检验，取95%可信区间。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 骨性关节炎患者软骨的病理学变化

HE染色排除正常对照组中存在含有疾病的软骨。与正常软骨相比，骨性关节炎软骨中软骨细胞减少、滑膜细胞增生、淋巴细胞浸润，严重者甚至出现斑片状钙化和纤维化，见图1。

2．2 软骨中线粒体酶mRNA的变化

RQ-PCR检测两组软骨中NDUFA1、SDHB、Cytb、COX、V-ATPase H、MDH、HADHSC的mRNA表达。结果显示，骨性关节炎软骨中NDUFA1及COX表达比正常软骨明显升高，差异有统计学意义（P＜0．05）；SDHB、Cytb及V-ATPase H表达比正常软骨明显下降，差异有统计学意义（P＜0．05）；MDH、HADHSC在两组中的表达差异无统计学意义。见图2。

2．3 蛋白质印迹检测软骨中线粒体酶的变化

为了验证RQ-PCR的结果，我们用蛋白质印迹进一步检测软骨中这7种酶的蛋白表达情况。结果显示，与正常软骨相比，NDUFA1、COX在骨性关节炎软骨中明显升高（P＜0．05或P＜0．01）；SDHB、Cytb、V-ATPase H在骨性关节炎软骨中明显下降（P＜0．05）。MDH、HADHSC在两组中的表达差异无统计学意义，见图3、图4。

3 讨论

骨性关节炎的发病机制尚不十分明确，近年来软骨细胞线粒体在骨性关节炎发生发展中所起的作用越来越受到重视。一方面线粒体可以通过线粒体途径介导软骨细胞的凋亡，另一方面又可以通过本身在细胞能量代谢中的作用介导细胞凋亡和通过影响ATP的平衡来直接诱发骨性关节炎的早期病损［7］。线粒体ATP的产生主要依靠内膜上的电子传递链完成。在线粒体呼吸链的电子传递过程中，电子的化学位能被复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ利用，将基质中的质子泵到膜间隙中，从而将能量储存在线粒体内膜两侧的质子电化学势梯度中，最后质子通过ATP酶回到基质中，其电化学势能被用来合成ATP分子［8－10］。呼吸链及最后偶联生成ATP的过程出现问题会导致线粒体功能障碍，进而影响软骨细胞的能量代谢，这可能与骨关节炎的软骨退变过程相关。

研究证实软骨细胞线粒体承担钙离子的转运并在细胞外基质的钙化中起到重要作用。矿物沉积主要在线粒体内的基质囊泡内形成，而且抑制线粒体电子传递链酶活性可以促进基质囊泡介导的软骨钙化［11－13］。我们通过对骨性关节炎患者软骨的病理学观察发现不少软骨存在基质钙化，而且这些软骨中线粒体关键酶发生了变化，推测这些线粒体关键酶数量的变化可能也与基质钙化相关，还需要进一步研究证实。

目前对于线粒体呼吸链酶复合体活性在骨性关节炎软骨中的变化研究较多，但是对于酶含量变化的研究较少。研究显示，与正常软骨相比，骨性关节炎软骨中的线粒体数量增多，呼吸链复合体Ⅱ和Ⅲ的活性明显下降，复合体Ⅰ的活性也下降，但是差异无统计学意义。复合体Ⅳ的活性在两组中无明显差异［14］。我们通过对两组软骨线粒体呼吸链关键酶表达的比较发现，骨性关节炎软骨中NDUFA1、COX增高，SDHB、Cytb、V-ATPase H下降，与呼吸链复合体的活性变化存在相同之处。在这些关键酶中COX是线粒体重要的结构蛋白，其含量的多少可以从侧面反映线粒体的质量，表达增高可能提示线粒体数量的增多，估计是一种补偿线粒体呼吸链功能下降的代偿机制。骨性关节炎软骨中SDHB、Cytb、V-ATPase H表达下降，推测这些酶表达量下降导致线粒体呼吸链酶活性降低，从而导致线粒体功能受损，ATP生成减少，线粒体功能的破坏使得细胞更多地依赖于糖酵解途径供能，这就让细胞更多地暴露于自由基的氧化损害之下，并最终被诱导凋亡。文献报道复合体Ⅱ和Ⅲ功能失调可能通过上调复合体Ⅰ这条低氧耗途径来补偿［15］，这可能是NDUFA1表达增高的原因之一。

基质中MDH是一个重要的涉及糖代谢的NAD＋依赖的酶，为基质标志酶。关于MDH与骨性关节炎的关系尚未见报道。本研究结果表明，与正常软骨相比骨性关节炎软骨中MDH变化无统计学意义，推测MDH在骨性关节炎发病中的作用并不重要。HADHSC也是线粒体的基质酶，参与脂类代谢，对于短链脂肪酸和中间产物的氧化至关重要。目前关于软骨是否能利用脂肪酸进行能量代谢的研究尚未见报道，也许软骨细胞能够利用脂肪酸代谢作为能量来源，但这些成分的重要性尚无定论。本研究中骨性关节炎软骨中HADHSC与正常软骨相比无明显差异，提示HADHSC可能与骨性关节炎的关系并不密切。

综上所述，NDUFA1、SDHB、Cytb、COX、V-ATPase H这些电子传递链酶在骨性关节炎软骨中表达出现了明显的改变，而MDH、HADHSC这两种线粒体基质酶在骨性关节炎软骨中的表达并无明显变化，推测线粒体电子传递链关键酶的变化可能在骨性关节炎的发病中起到重要的作用。进一步研究这些线粒体酶变化的机制，将会更为详细地揭示线粒体酶与骨性关节炎发病之间的关系。

［1］ Hardingham T．Extracellular matrix and pathogenic mechanisms in osteoarthritis［J］．Curr Rheumatol Rep，2008，10（1）：30－36．

［2］ Lotz M．Osteoarthritis year 2011 in review：biology［J］．Osteoarthritis Cartilage，2012，20（3）：192－196．

［3］ Loeser RF．Aging and osteoarthritis［J］．Curr Opin Rheumatol，2011，23（5）：492－496．

［4］ 何仁豪，王维山，董金波，等．miR-27a、miR-146a在骨性关节炎患者滑膜组织中的表达及临床意义［J］．实用医学杂志，2013，29（9）：1416－1419．

［5］ Rego-Perez I，Fernandez-Moreno M，Soto-Hermida A，et al．Mitochondrial genetics and osteoarthritis［J］．Front Biosci（Schol Ed），2013，5：360－368．

［6］ 潘剑英，沈俊，张荣凯，等．基于线粒体PCR基因芯片的骨关节炎发病机制［J］．中国组织工程研究，2012，16（46）：8575－8581．

［7］ 刘恒，刘超，曹永平，等．软骨细胞线粒体功能异常在关节软骨早期退变中的作用［J］．中国矫形外科杂志，2011，19（8）：652－654．

［8］ 毛睿睿，薛耀明，林占，等．高糖和游离脂肪酸诱导胰岛INS-1细胞线粒体呼吸链改变的研究［J］．实用医学杂志，2009，25（11）：1730－1732．

［9］ Martin JA，Martini A，Molinari A，et al．Mitochondrial electron transport and glycolysis are coupled in articular cartilage［J］．Osteoarthritis Cartilage，2012，20（4）：323－329．

［10］ 孙飞，周强军，孙吉，等．线粒体呼吸链膜蛋白复合体的结构［J］．生命科学，2008，20（4）：566－576．

［11］ Blanco FJ，López-Armada MJ，Maneiro E．Mitochondrial dysfunction in osteoarthritis［J］．Mitochondrion，2004，4（5／6）：715－728．

［12］ Blanco FJ，Rego I，Ruiz-Romero C．The role of mitochondria in osteoarthritis［J］．Nat Rev Rheumatol，2011，7（3）：161－169．

［13］ Cillero-Pastor B，Rego-P rez I，Oreiro N，et al．Mitochondrial respiratory chain dysfunction modulatesmetalloproteases－1，－3 and－13 in human normal chondrocytes in culture［J］．BMC Musculoskelet Disord，2013，14：235．

［14］ Maneiro E，Martín MA，de Andres MC，et al．Mitochondrial respiratory activity is altered in osteoarthritic human articular chondrocytes［J］．Arthritis Rheum，2003，48（3）：700－708．

［15］ Liu JT，Guo X，MaWJ，etal．Mitochondrial function is altered in articular chondrocytes of an endemic osteoarthritis，Kashin-Beck disease［J］．Osteoarthritis Cartilage，2010，18（9）：1218－1226．

Expression of certain m itochondrion enzymes in cartilages of osteoarthritis

QIANWei1，Bipin Kumar RAI1，YUAN Ji-shan2，LIU Yan-fang3，GU Yun1，CHEN Qin3，XIE Jun2，ZHANGMing3，MA Yong-ming1
（1．Department of Otolaryngology，2．Departmentof Orthopaedics，3．Departmentof Central Laboratory，the Affiliated People’s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To compare the expressions of seven importantmitochondrion enzymes in osteoarthritis（OA）cartilages and normal cartilages．M ethods：Specimens of human articular cartilage were collected from a total of 9 osteoarthritis patients and 12 normal controls．H＆E staining showed the histologic structure of cartilage．Expressions of NDUFA1（NADH dehydrogenase ubiquinone 1 alpha subcomplex 1），succinate dehydrogenase complex（SDHB），cytochrome b（Cytb），COX（cytochrome c oxidase），V-ATPase H（vacuolar-type H＋-ATPase），cytosolic malate dehydrogenase（MDH），hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase（HADHSC）were detected by RQ-PCR and Western-blot．Results：Compared with normal cartilage，synoviocytes proliferation and lymphocytes infiltration could be observed in osteoarthritis group．The expressions of NDUFA1 and COX increased in osteoarthritis cartilages，expressions of SDHB，Cytb，V-ATPase H decreased in osteoarthritis cartilages．The differences were statistically significant（P＜0．05）．There was no statistical significance in MDH and HADHSC expression between the two groups．Conclusion：Changes of some importantmitochondrion enzymesmay play an important role in pathopoiesis of osteoarthritis．

osteoarthritis；cartilage；mitochondrion；enzymes

钱炜（1962—），男，江苏镇江人，主任医师，博士，主要从事耳鼻咽喉临床和基础研究。

R684．3

A

1671－7783（2014）06－0505－05

10．13312／j．issn．1671-7783．y140231

江苏省“六大人才高峰”高层次人才资助项目（2011-WSN021D）；江苏省医学科研招标立项课题（H201353）；镇江市科技支撑社会发展项目（SH2012042）

2014－08－19 ［编辑］何承志