陆喆，束波，吴柳松，钱民章

（遵义医学院生物化学教研室，贵州遵义563003）

胆固醇对人脐静脉内皮细胞活性氧生成及细胞凋亡的影响

陆喆，束波，吴柳松，钱民章

（遵义医学院生物化学教研室，贵州遵义563003）

目的：探讨胆固醇对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）活性氧生成及细胞凋亡的影响。方法：分别用12．5，25，50，100mg／L的胆固醇与HUVECs作用24 h，用50mg／L胆固醇与HUVECs分别作用6，12，24，48 h，流式细胞术（FCM）检测细胞内活性氧（ROS）的生成量。分别用12．5，25，50，100 mg／L的胆固醇以及50 mg／L胆固醇＋N-乙酰半胱氨酸（NAC）与HUVECs孵育24 h，MTT法测定细胞活力，FCM检测细胞凋亡率。结果：12．5，25，50，100 mg／L胆固醇作用HUVECs 24 h后，均可诱导HUVECs中ROS升高，与对照组（不加胆固醇）比较差异有统计学意义（P＜0．01）；50mg／L范围内组间差异明显（P＜0．01），呈剂量依赖性。50mg／L胆固醇作用HUVECs6，12，24，48 h后细胞内ROS生成量均明显高于对照组（P＜0．01）；24 h内组间差异明显（P＜0．01），呈时间依赖性。MTT结果显示，12．5，25，50，100 mg／L胆固醇作用HUVECs24 h后均能降低细胞的存活率，加入抗氧化剂NAC后，细胞存活率明显升高（P＜0．01）。凋亡率分析结果表明，50，100 mg／L胆固醇作用HUVECs 24 h后，凋亡率比对照组明显上升（P＜0．01），加入抗氧化剂NAC后凋亡率明显下降（P＜0．01）。结论：胆固醇可通过诱导HUVECs中ROS的升高，促进HUVECs的凋亡。

胆固醇；人脐静脉内皮细胞；活性氧；细胞凋亡

胆固醇是生物体内一种重要的类脂，在血中以脂蛋白的形式运输。当体内脂类代谢异常时，胆固醇进入细胞过多或者逆向转运障碍，细胞对胆固醇摄取与排除的平衡被打破，血管细胞内或细胞间就有可能出现胆固醇的蓄积。这一现象无论在人体自然发生，还是实验动物用高饱和脂肪和高胆固醇诱导产生的动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）中均得到证实［1］。了解这些蓄积在血管细胞间和细胞内的游离胆固醇对血管的结构与功能造成的影响，对认识胆固醇致动脉粥样硬化的机制很有必要。

血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）是构成血管内皮层的基本单位，是参与动脉粥样硬化形成的主要细胞之一。VEC增殖与凋亡的平衡与否关系到血管内皮的完整性和内皮多种功能的发挥。有研究发现在动脉粥样硬化斑块表面的内皮细胞更新的频率极快，提示高频率的内皮细胞凋亡启动了动脉粥样硬化病变［2］。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是导致VEC凋亡的重要因素之一［3］。本课题组前期研究发现，50 mg／L胆固醇作用于人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）后，细胞内ROS水平升高［4］，且这些ROS主要来源于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH）［5］，但HUVECs中ROS的生成量与胆固醇作用的时间及剂量之间的关系以及生成的ROS是否会诱导内皮细胞凋亡尚不清楚，本研究对此进行了观察。

1 材料与方法

1．1 材料

HUVECs细胞株（中南大学湘雅细胞库），胆固醇（Sigma公司），1640培养基、胎牛血清（Hyclone，USA），2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA，Sigma公司），噻唑蓝（MTT）、AnnexinV／PI联染试剂盒（南京凯基生物科技公司）。

1．2 主要仪器

超净工作台（苏州净化设备厂）；细胞培养箱（BeckMan公司）；倒置显微镜（日本Olympus公司）；流式细胞仪（BeckMan公司）；酶标仪（Bio-Rad公司）。

1．3 流式细胞术检测HUVECs中ROS的生成

以1×106个细胞／孔接种HUVECs于6孔板中，培养24 h后，同步化24 h。分别用12．5，25，50，100 mg／L的胆固醇与HUVECs孵育24 h，以不加入胆固醇的HUVECs为对照组；用50 mg／L胆固醇与HUVECs分别孵育0，6，12，24，48 h。以DCFH-DA为荧光探针，流式细胞术检测ROS的生成量。

1．4 MTT比色法检测细胞存活率

以1×104个细胞／孔接种于96孔板中，培养24 h后，同步化24 h，边缘孔用无菌PBS填充。分别用12．5，25，50，100 mg／L的胆固醇以及50 mg／L胆固醇＋N-乙酰半胱氨酸（NAC）与HUVECs孵育24 h；之后每孔加入20μLMTT溶液（5 mg／mL，即0．5% MTT），继续培养4 h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶标仪490 nm处测量各孔的光密度（D）值。同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养基、MTT、二甲基亚砜）。存活率＝（实验组D值－调零D值）／（对照D值－调零D值）×100%

1．5 流式细胞术检测细胞凋亡

分别用12．5，25，50，100 mg／L的胆固醇以及50 mg／L胆固醇＋NAC与HUVECs孵育24 h，离心收集各组细胞，调整细胞密度为1×106／mL，吸取各组490μL细胞悬液，分别加入5μL AnnexinV和5 μL PI，4℃避光孵育10 min，流式细胞仪分析每组10 000个细胞，获得凋亡率。

1．6 统计学处理

2 结果

2．1 HUVECs内ROS的生成量

2．1．1 剂量效应 12．5mg／L的胆固醇与HUVECs作用24 h即可诱导HUVECs中ROS明显升高，随着胆固醇质量浓度增大，ROS生成量逐渐增加；各剂量组与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0．01）；各剂量组间除50 mg／L和100 mg／L胆固醇组ROS生成量差异无统计学意义外，其余各组间差异均有统计学意义（P＜0．01）。见图1。

2．1．2 时间效应 50 mg／L胆固醇作用HUVECs 6 h后细胞内ROS生成量即明显高于对照组，随作用时间延长（不超过24 h），ROS生成量逐渐增加，各时间组与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0．01）；各时间组间比较差异均有统计学意义（P＜ 0．01），作用24 h后细胞内ROS水平上升明显，作用48 h比作用24 h细胞内ROS水平明显降低（P＜0．01）。见图2。

2．2 MTT法测定细胞存活率

MTT结果显示，实验所设置的4个质量浓度胆固醇均能降低HUVECs的存活率，与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0．01）。50 mg／L胆固醇加入抗氧化剂NAC后，相比50 mg／L胆固醇作用组细胞存活率明显上升（P＜0．01）。见图3。

2．3 流式细胞术检测细胞凋亡率

流式细胞术检测结果显示，各剂量组胆固醇作用HUVECs后，与对照组相比凋亡率明显上升（P＜0．01）；50 mg／L胆固醇加抗氧化剂NAC组比50 mg／L胆固醇组凋亡率明显下降（P＜0．01）。见图4、图5。

3 讨论

本实验观察了胆固醇对内皮细胞ROS生成的剂量以及时间效应，结果表明12．5，25，50，100 mg／L的胆固醇在作用细胞24 h后，细胞内ROS生成量随着胆固醇质量浓度的增大而升高，与对照组比较差异有统计学意义，且在50 mg／L范围内呈现剂量依赖性。用50 mg／L胆固醇分别作用细胞6，12，24， 48 h，细胞中ROS的生成量与对照组比较明显增加，在24 h内呈现时间依赖性；作用24 h ROS生成量达到最高峰。这一结果进一步证实了胆固醇在体外可诱导HUVECs中ROS生成，并且在一定的范围内有剂量和时间依赖性。实验中发现胆固醇质量浓度达到100 mg／L时，ROS的升高和50mg／L相比差异并没有统计学意义，且50 mg／L胆固醇作用48 h组ROS生成量比24 h组明显减少，原因尚待研究。

既往研究表明，许多内源性或外源性危险因子如高血糖［7］、高血压及机械应激［8－9］都通过诱导心血管细胞和免疫细胞中NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶、脂质氧合酶产生氧化应激，引起ROS生成增多［10］。当调节ROS的抗氧化酶系统超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶被耗尽时，引起线粒体功能障碍，通过调节过氧化物酶体增殖体受体γ共激活因子1（peroxisome proliferator activated receptorγcoactivator，PGC-1）激活线粒体DNA损伤途径，致氧化呼吸链功能缺陷，最终导致内皮细胞凋亡［11］。

为了解胆固醇诱导HUVECs中ROS水平升高对HUVECs生存的影响，本研究采用MTT比色法检测胆固醇作用后细胞的存活率。我们选择了12．5，25，50，100 mg／L的胆固醇作用细胞24 h，结果显示，4种质量浓度的胆固醇作用HUVECs 24 h之后，与对照组相比细胞存活率均显著下降；加入抗氧化剂NAC后，细胞存活率明显升高。这些数据说明胆固醇诱导生成的ROS明显降低了细胞的存活率。

流式细胞术检测细胞凋亡率结果显示，4种质量浓度胆固醇作用HUVECs 24 h后，与对照组相比细胞凋亡率均升高；在50 mg／L质量浓度范围内呈现剂量依赖性，加入抗氧化剂NAC组较胆固醇单独作用组凋亡率低，说明胆固醇能通过诱导ROS升高，促进HUVECs的凋亡。

综上所述，胆固醇通过诱导HUVECs中ROS的升高，促进HUVECs的凋亡。内皮细胞凋亡是动脉粥样硬化形成的独立危险因素［11］。本研究结果为认识高脂血症致动脉粥样硬化的机制提供了新的实验资料。

［1］ 唐朝克．以ABCA1为靶点防治动脉粥样硬化［J］．中国动脉硬化杂志，2011，19（11）：879－883．

［2］ Choy JC，Granville DJ，Hunt DW，et al．Endothelial cell apoptosis：biochemical characteristics and potential implications for atherosclerosis［J］．JMol Cell Cardiol，2001，33（9）：1673－1690．

［3］ Libby P，Ridker PM，Hansson GK．Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis［J］．Nature，2011，473（7347）：317－325．

［4］ 汪慧星，杨一峻，钱民章．胆固醇致人血管内皮细胞DNA损伤［J］．中国生物化学与分子生物学报，2012，28（5）：442－448．

［5］ 权媛，钱民章．胆固醇通过NADPH氧化酶诱导ROS升高，NF-κB激活进而导致内皮细胞损伤［J］．中国病理生理杂志，2010，26（8）：1521－1526．

［6］ Sitia S，Tomasoni L，Atzeni F，et al．From endothelial dysfunction to atherosclerosis［J］．Auto immun Rev，2010，9（12）：830－834．

［7］ Nakagami H，Kaneda Y，Ogihara T，et al．Endothelial dysfunction in hyperglycemia as a trigger of atherosclerosis［J］．Curr Diabetes Rev，2005，1（1）：59－63．

［8］ Heo KS，Lee H，Nigro P，et al．PKCζmediates disturbed flow-induced endothelial apoptosis via p53 SUMOylation［J］．JCell Biol，2011，193（5）：867－884．

［9］ Nigro P，Abe J，Berk BC．et al．Flow shear stress and atherosclerosis：amatter of site specificity［J］．Antioxid Redox Signal，2011，15（5）：1405－1414．

［10］ Park JG，Oh GT．The role of peroxidases in the pathogenesis of atherosdersis［J］．BMB Rep，2011，44（8）：497－505．

［11］ Dimmeler S，Haendeler J，Zeiher AM．Regulation of endothelial cell apoptosis in atherothrombosis［J］．Curr Opin Lipidol，2002，13（5）：531－536．

Effect of cholesterol on ROS generation and cell apoptosis in human umbilical vein endothelial cells

LU Zhe，SHU Bo，WU Liu-song，QIAN Min-zhang
（Department of Biochemistry and Molecular Biology，ZunyiMedical College，Zunyi Guizhou 563003，China）

Objective：To explore the effect of cholesterol on reactive oxygen species（ROS）generation and cell apoptosis in human vascular endothelial cells．M ethods：HUVECswere treated with different cholesterol concentrations（12．5，25，50，100 mg／L）for24 hours and were stimulated with 50 mg／L cholesterol at different times（0，6，12，24，48 h）．Flow cytometry detected ROS generation．HUVECswere treated with different cholesterol concentrations and Nac．HUVECs survival rate were examined by MTT colorimetric assay and apoptosis rate were examined by flow cytometry．Results：The results showed that the level of ROS will all be elevated when HUVECswere treated with 12．5，25，50，100 mg／L cholesterol for 24 h respectively．Compared with the control group，there was a significant difference（P＜0．01）．It had a significant difference between each groups（P＜0．01）in the range of 50 mg／L，and appeared dose-dependentmanners．HUVECswere processed by 50 mg／L cholesterol for 6，12，24 and 48 hours，the level of ROSgeneration were significantly higher than control group（P＜0．01）；within 24 h emerge significant difference between each groups（P＜0．01），and appeared the time-dependentmanners．The results of MTT showed that 12．5，25，50，100 mg／L cholesterol could reduce the cell survival rate，and adding NAC could enhance survival rate．After HUVECswere processed by 50 mg／L or 100 mg／L cholesterol for 24 h，apoptosis rate was higher than control group（P＜0．01），and the apoptosis rate were decline by adding antioxidants NAC．Conclusion：Cholesterol can enhance the level of ROS in HUVECs，and increase the HUVECs apoptosis．

cholesterol；human vascular endothelial cells；reactive oxygen species；apoptosis

陆喆（1989—），男，硕士研究生；钱民章（通讯作者），教授，博士生导师，E-mail：qian＿mzh＠hotmail．com

R543．5

A

1671－7783（2014）06－0466－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140240

贵州省科学技术基金资助项目（黔科合J字［2009］2178号）

2014－09－15 ［编辑］ 何承志