廖鹏，何庆华，彭海燕，李飞飞，邢桂磊，张勇

长时间离心运动过程中及运动后不同来源ROS介导大鼠骨骼肌核因子Kappa B核转入

廖鹏1，何庆华2，彭海燕2，李飞飞2，邢桂磊2，张勇3

目的：观察长时间离心运动过程中和运动后大鼠骨骼肌不同来源ROS与核因子Kappa B（NFκB）核转入的关系。方法：3月龄雌性SD大鼠30只随机分为5组（n=6）。6只大鼠作为不运动对照（C），安静状态下处死；其余大鼠以25 m/min、-10%跑台运动，分别于运动1 h（E1 h）、运动2 h（E2 h）、运动2 h后6 h（E2 h+6）和24 h（E2 h+24）处死动物。结果：（1）E1 h、E2 h和E2 h+24骨骼肌核蛋白p65表达量较C显著提高，E2 h+6核p65表达量较E2 h显著降低；（2）骨骼肌顺乌头酸酶活性在E1 h、E2 h和E2 h+6较C显著降低，在E2 h+6和E2 h+24较E2 h显著提高；（3）E2 h+24骨骼肌H2O2含量较C显著升高；（4）E2 h+24骨骼肌髓过氧化物酶活性较C和E2 h显著提高；（5）各组骨骼肌MnSOD mRNA表达量无组间差异，但E2 h、E2 h+6和E2 h+24骨骼肌TNF mRNA表达量较C显著提高；（6）血清HMGB1含量C组显著低于E1 h、E2 h和E2h+24；E2 h+24较E2 h显著提高；（7）随运动和运动后时间延长，骨骼肌形态学异常及炎细胞浸润逐渐增多。结论：来自骨骼肌线粒体和呼吸爆发的ROS可能先后分别参与了运动过程和运动后2次NFκB核转入的触发。

氧化还原状态；线粒体；延迟性肌肉损伤；呼吸爆发；p65

骨骼肌的剧烈收缩会导致细胞启动和关闭一系列基因的表达以应答运动应激[1]。NFκB是一种具备多向调节作用的转录因子，其活化及失活是细胞应答运动的最重要基础之一[2-3]。NFκB活化的关键步骤是由胞浆转位入核，这一过程由细胞亲氧化状态启动，应激刺激严重时一些炎症因子（如HMGB1）也参与这一过程[3]。但是，已知多途径参与运动骨骼肌ROS生成[5]，不同来源的ROS是否都参与运动应激中NFκB核转入，何时参与，贡献如何，目前并无证据给出明确解释。

长时间离心运动会导致线粒体ROS大量生成，同时造成骨骼肌损伤又会引起延迟性呼吸爆发。本研究的目的是观察由长时间离心运动导致的不同ROS来源对NFκB核转入的影响，这一问题的探索无疑会对深化理解NFκB这一多种病理生理干预靶向做出贡献。

1 材料与方法

1.1 实验动物

3月龄健康雌性SD大鼠30只，体重（278.7±16.3）g（250～ 300 g），购自军事医学科学院实验动物中心，实验动物质量合格证号0047959，在通风、温度、湿度适宜的动物室内饲养。

1.2 运动模型及分组

新环境饲养1周后，所有SD大鼠每日以15 m/min、0%坡度运动15 min。1周后重新称重，将30只大鼠随机分为5组，每组6只，分别于跑台以25 m/min、-10%坡度运动。以运动前安静状态（C）、运动1 h（E1 h）、运动2 h（E2 h）、运动2 h后6 h（E2 h+6）和运动2 h后24 h（E2 h+24）为实验观测记录点。运动过程采用声音或毛刷刺激大鼠尾部，所有运动动物均能完成设定时间的运动。

1.3 组织准备

于各实验观测点10%水合氯醛麻醉后活杀动物，腹主动脉穿刺取血分离血清，-20℃保存，取股外侧肌肉10%甲醛钙固定或-80℃保存。

1.4 骨骼肌核蛋白抽提

用Pierce NE-PER®Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents kit进行核蛋白抽提。

1.5 骨骼肌线粒体抽提

缓冲介质冲洗骨骼肌后匀浆，4℃600 g离心；薄纱布过滤后4℃1 7000 g离心；5 mL缓冲介质悬浮线粒体沉淀。

1.6 骨骼肌NFkB亚基p65核蛋白表达量测定

Western Blot测定骨骼肌细胞核NFkB亚基p65核蛋白表达量。核蛋白定量后，常规电泳分离、转膜；Rabbit Anti-NFκB p65 IgG、和Mouse Anti-α-Tubulin IgG分别用PBST稀释成1：100和1：500的工作液，Goat Anti Rb IgG-HRP和Goat Anti Mouse IgG-HRP用PBST稀释成1：10 000和1：2 000的工作液；一抗室温孵育2 h，二抗室温孵育1 h；以ECL反应液做发光底物，反应后与X光胶片压片、显影、定影；以凝胶成像系统拍片。

1.7 骨骼肌线粒体顺乌头酸酶相对活性测定

取线粒体加入细胞裂解液提取顺乌头酸酶；加反应缓冲液测反应体系240 nm下1 min中内吸光值变化。以各实验观测点吸光度变化相对于安静状态吸光度变化的比值反映顺乌头酸酶相对活性。

1.8 骨骼肌髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）活性测定

按南京建成生物工程研究所试剂盒说明将定量骨骼肌蛋白及各种试剂按比例混合、分步骤反应。460 nm处测OD值，以每克蛋白在37℃反应体系中H2O2被分解1 mmol定义为1个MPO活性单位（U/mg pro）。

1.9 骨骼肌H2O2含量测定

按南京建成生物工程研究所试剂盒说明将骨骼肌蛋白及各种试剂按比例混合、分步骤反应后，于405 nm处测吸光度值，H2O2含量单位为nmol/mg pro。

1.10 骨骼肌MnSOD、TNFa mRNA表达量测定

实时荧光定量PCR用于检测骨骼肌MnSOD、TNFa基因表达。取骨骼肌液氮下研磨，加1mlTrizol匀浆，抽提总RNA。琼脂糖凝胶电泳观察条带完整性，测OD260/280值>1.8，计算RNA含量。

取2 ug RNA进行逆转录。引物序列：MnSOD，上游5'-AGAGTTGCTGGAGGCTATCAAG-3'，下游50-CAGTGGGT CCTGATTAGAGCA-3'；TNFa，上游5'-TACTGAACTTCGGGG TGATTGGTCC-3'，下游5'-CTTGGCCAGCGCCTCGTGGT-3'；β-Actin，上游5'-TGGTGGGTATGG GTCAGAAGGACTC-3'，下游5'-CATGGCTGGGGT GTT GAAGGTCTCA-3'。

cDNA样品与SYBR GREEN、上游和下游引物混合，短暂离心后进行扩增反应。以β-Actin为内参，根据公式2-□□Ct计算目的基因相对表达量。

1.11 血清HMGB1含量

血清HMGB1含量按Shino-Test公司的ELISA试剂盒说明测定。酶标仪测450 nm处吸光值，血清中HMGB1浓度与颜色的深浅、OD值大小呈正相关，根据标准品和样品的OD值，计算样本中HMGBl含量。

1.12 骨骼肌形态学变化

骨骼肌固定、切片后HE染色观察形态学改变。动物麻醉后迅速取骨骼肌切块，10%甲醛钙固定；修整、脱水、透明、浸蜡后制成蜡块，切片4 μm厚。切片二甲苯I、II、III脱蜡，梯度酒精脱水；苏木素、伊红染色；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。显微镜观察。

1.13 统计学处理

实验数据由均值±标准误表示。用SPSS17.0对数据进行单因素方差分析。F值显著性（P<0.05），用Bonferroni（方差具有齐次性）或Tamhane（方差不具齐次性）进行2组间差异的检验。所有检验的显著性水平定为P<0.05。

2 结果

2.1 骨骼肌NFkB亚基p65核蛋白表达量

E1h（P<0.01）、E2 h（P<0.01）和E2 h+24（P<0.01）骨骼肌细胞核NFκB亚基p65表达量较C显著提高，E2 h+6（P<0.01）核p65表达量较E2 h显著降低（见图1）。

图1 长时间离心运动对骨骼肌细胞核p65表达量的影响Figure1 Western blot analysis of p65 in the nuclear extraction of rat skeletal muscle withtubulin served as control

2.2 骨骼肌线粒体顺乌头酸酶活性

E1h（P<0.05）、E2 h（P<0.05）和E2 h+6（P<0.05）骨骼肌线粒体顺乌头酸酶活性较C显著降低；E2 h+6（P<0.05）和E2 h+24（P<0.05）顺乌头酸酶活性较E2 h显著升高（见图2）。

图2 长时间离心运动对骨骼肌线粒体顺乌头酸酶活性的影响Figure2 Activities of mitochondrial aconitase in rat skeletal muscle

2.3 骨骼肌MPO活性

E2 h+24骨骼肌MPO活性较C（P<0.05）和E2 h（P<0.05）显著升高（见图3）。

图3 长时间离心运动对骨骼肌MPO活性的影响Figure3 Activities of MPO in rat skeletal muscle

2.4 骨骼肌H2O2含量

E2 h+24骨骼肌H2O2含量较C（P<0.05）显著升高（见图4）。

图4 长时间离心运动对骨骼肌H2O2含量的影响Figure4 Concentrations of H2O2in rat skeletal muscle

2.5 骨骼肌MnSOD及TNFa mRNA表达

骨骼肌MnSOD mRNA表达量无组间差异（见图5）。E2 h、E2 h+6和E2 h+24骨骼肌TNFa mRNA表达量较C显著提高（P<0.05）；E2 h+6和E2 h+24骨骼肌TNFa mRNA表达量较E2 h显著提高（P<0.05）（见图5）。

2.6 血清HMGB1含量

E1 h（P<0.05）、E2 h（P<0.01）和E2 h+24（P<0.01）血清HMGB1含量较C显著提高；E2 h+6血清HMGB1含量较E2 h显著降低（P<0.01）；E2 h+24血清HMGB1含量较E2 h显著提高（P<0.01）（见图6）。

图5 长时间离心运动对骨骼肌MnSOD和TNF mRNA含量的影响Figure5 Real-time PCR analysis of MnSOD and TNF in rat skeletal muscle

图6 长时间离心运动对血清HMGB1含量的影响Figure6 Serum HMGB1concentrations during and after downhill running

2.7 骨骼肌的形态学变化

HE染色C组表现正常骨骼肌细胞形态（见图7A），Ex1 h组骨骼肌细胞横纹偶见灶性模糊（见图7B），E2 h组骨骼肌细胞见散在横纹消失及间质充血（见图7C），E2+6 h部分骨骼肌细胞横纹消失（见图7D）。间质散在血管扩张充血及炎细胞浸润，E2 h+ 24组骨骼肌细胞横纹大部分消失，胞浆淡染，核中移，间质炎症细胞浸润（见图7E）。

图7 长时间离心运动前后骨骼肌细胞的形态学变化Figure7 Hematoxylin and eosin stain of skeletal muscle in rats

3 讨论

哺乳动物NFκB异源二聚体p50/p65只有从胞浆转位至细胞核才能与应答元件结合启动和/或关闭靶基因表达[2-3]。这一过程需要细胞的氧化环境触发一系列激酶反应，最终通过胞浆p50/p65抑制因子IκB的酶解，暴露出p65的核定位信号并被转运受体识别后才能发生，核p65蛋白表达量的显著提高是其重要标志[3]。ROS是哺乳动物骨骼肌细胞最重要的氧化剂，也是细胞氧化还原状态最重要的调节因子[4-5]。但是，骨骼肌细胞存在多种ROS生成途径[5]，这些途径生成的ROS是否都参与、何时参与NFκB核转入、参与程度如何，目前并无研究做出满意解释。

线粒体呼吸链电子漏出和呼吸爆发是长时间离心运动骨骼肌ROS的2个主要生成途径[4-5]。长时间的骨骼肌收缩在提高线粒体呼吸链能量转换效率的同时会通过电子漏生成大量ROS，而长时间离心运动又会导致运动骨骼肌微损伤，诱发延迟性呼吸爆发及炎症反应，积极参与对损伤骨骼肌的修复[6]。

超氧阴离子（O2—.）是线粒体电子漏生成的第一个ROS，可特异性氧化顺乌头酸酶活性基团铁硫簇[7]。线粒体顺乌头酸活性水平与O2—.生成速率呈反比，能够精确反映线粒体ROS的生成速率[8]。本研究观察到，运动过程中线粒体顺乌头酸酶活性的显著降低一直持续到2 h运动后6 h，至2 h运动后24 h其活性又恢复正常。表明，在长时间有氧运动过程中显著提高的线粒体ROS生成速率一直持续至运动后，但随运动结束时间的延长，伴随骨骼肌能量需求相对降低，线粒体ROS生成速率又降低至安静水平。

MPO是细胞呼吸爆发的标志酶[6]。长时间离心运动造成的运动骨骼肌微损伤会启动细胞炎症等保护机制。炎症部位的趋化吞噬细胞释放蛋白酶和产生大量氧代谢物易化清除、吞噬异物。其中，吞噬细胞MPO利用NADPH氧化酶催化生成的H2O2和氯离子产生次氯酸，形成更具氧化活性的自由基。因此，MPO活性提高意味着大量ROS生成，是趋化吞噬细胞的功能和激活标志。本研究观察到，离心运动后24 h骨骼肌MPO活性较运动前和运动过程显著升高，表明本研究离心运动模式确实诱导了延迟性呼吸爆发。的确如此，在对应时间点（运动后24 h），确实观察到骨骼肌H2O2含量较运动前显著升高。形态学证据也表明，随运动和运动后时间延长，运动骨骼肌细胞损伤和炎症细胞浸润程度逐渐加重。

但是，本研究离心运动至结束后6 h内并未出现骨骼肌H2O2含量的显著性改变。提示，骨骼肌氧还状态并未随运动过程中线粒体ROS生成速率的显著提高而改变。事实上，细胞ROS生成速率的提高并不总意味着其细胞水平的显著改变。运动过程中细胞的抗氧化系统总是努力将氧化还原状态维持在稳定水平，NFκB的核转入活化参与这一稳态平衡的维持[1，5]。

本研究的重要结果是，与长时间离心运动中和运动后24 h先后观察到的2个不同来源的ROS生成增多峰相对应，运动骨骼肌细胞NFκB亚基p65的核蛋白表达量也在运动过程中和运动后24 h先后依次显著提高。表明，运动过程中和运动后24 h先后依次出现了2次胞浆NFκB的核转入，且这2次NFκB核转入可用长时间离心运动中和运动后不同来源的ROS解释。

NFκB是一个多效能的转录因子，可接受上百种细胞刺激，参与启动上百个基因的表达[2]。如果2个不同来源的ROS先后分别参与启动NFκB在运动过程中和运动后的2阶段活化的话，必然有其特殊的生理意义。本文认为，NFκB在运动过程中的第1次活化可能与细胞对运动应激的快速应答有关[1]。这一细胞生理过程可能涉及能量转换、氧化还原稳态以及肌肉、血管和氧张力调节等各个方面。作为NFκB靶点的一些转录因子、抗氧化酶、急性期蛋白、低氧诱导因子乃至一些早期炎症因子在长时间运动中的表达无不与之有关。

为验证上述推论，在本研究中观察了NFκB的2个靶基因MnSOD和TNFa mRNA在运动前后骨骼肌的表达量变化。Mn-SOD在线粒体歧化超氧阴离子为过氧化氢而阻止通过Haber-Weiss反应产生更为活跃的ROS羟自由基，而运动过程中线粒体是超氧阴离子的主要来源，但是没有观察到MnSOD mRNA在运动前后的显著性差异。事实上，多数研究都注意到急性运动过程中MnSOD基因表达量不会出现显著变化。HOLLANDER等[9]观察到，急性力竭运动活化骨骼肌NFκB，而MnSOD mRNA表达量较安静状态的显著提高出现在运动后1～2 h。此外，可能有氧运动过程中机体的抗氧化系统足以对抗伴随的氧化应激。本研究中，线粒体ROS生成速率在运动过程中升高，但H2O2水平维持不变也似乎支持这一假设。

TNFa是公认的早期促炎因子，在组织炎症、细胞趋化、免疫介导、损伤修复等一系列非特异性应激应答中扮演重要角色。本研究观察到，TNFa mRNA表达量随运动和运动后时间延长逐渐增高。NFκB在运动中的活化选择性启动靶基因表达值得关注。

NFκB诸多抑制因子也是其自身的靶基因。NFκB活化的触发因素一旦去除，如本研究中线粒体ROS生成速率下降时，这些前期表达的NFκB抑制因子会迅速入核将p65核转出[10]。这可能是本研究运动后6 h骨骼肌细胞核p65蛋白表达量下降的原因。

但是TNFa mRNA表达量为什么在NFκB核转入减弱后仍随运动后时间延长逐渐增高？骨骼肌长时间的拉长式收缩还会导致延迟性呼吸爆发，其ROS生成速率和量显著高于线粒体呼吸链，很可能是本研究运动后24 h H2O2水平显著提高的原因。近期研究表明，呼吸爆发而非线粒体呼吸链来源的ROS才是损伤组织免疫、修复的重要原因[11]。在运动后24 h观察到的NFκB第2次核转入很可能由呼吸爆发生成的ROS参与触发。此次，NFκB活化的生理意义可能涉及免疫与修复，主要表现为次晚期和晚期炎症因子、抗氧化酶类等细胞因子的表达[12]，是机体对不适宜运动适应的重要细胞事件。

本研究另一重要结果是，血清HMGB1含量也出现了运动前后2次升高，且运动后24 h的增加水平显著高于运动2 h。HMGB1是一种高度保守的核蛋白，也是公认的具有重要临床意义的晚期促炎因子。与细胞膜RAGE结合后，HMGB1就会通过影响胞浆氧还状态激活NFκB、MAPK、纤溶酶原激活抑制物、Cdc42与Rac等一系列调节因子，从而放大促炎效应[12]，HMGB1在运动应答中的重要意义必然会成为运动医学的研究热点。

4 小结

长时间离心运动中，线粒体ROS生成增多和运动结束后延迟性呼吸爆发可能分别是运动过程中和运动结束后2次NFκB核转入的重要诱因。

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Different Sources of ROS Contribute to NFκB Nuclear Import in Rat Skeletal Muscle During and After EccentricExercise

LIAO Peng1，HE Qinghua2，PENG Haiyan2，Li Feifei2，XING Guilei2，ZHANG Yong3
（1.Dept.of Health and Sport Science，Tianjin University of Sport，Tianjin 300381，China；2.Dept.of Postgraduate，Tianjin University of Sport，Tianjin 300381，China；3.Institute of Sport Medicine，Tianjin University of Sport，Tianjin 300381，China）

Aim：To investigate the contribution of different sources of ROS to NFκB nuclear import in rat skeletal muscle during and after eccentric exercise. Methods：Female SD rats（age 3 mo）were randomly divided into the following five groups（n=6）：ran on the treadmill at 25 m/min，-10%grade for 1（E1h）or 2 h（E2 h）and were killed immediately；ran for 2 h and killed at 6 h（E2 h+6）or 24 h（E2 h+24）after exercise；or killed at rest as controls（C）.Results：The nuclear accumulation of p65 showed progressive increases in muscles during eccentric exercise.This change was accompanied by a progressive decrease of mitochondrial aconitase activity.At 24 h，there were marked increases in H2O2concentration，myleoperoxidase activity，and inflammatory cell infiltration along with nuclear accumulation of p65 in muscle.The serum contents of HMGB1 were significantly elevated during exercise and at 24h after exercise.For muscular target genes of NFκB activation，no significant differences of MnSOD mRNA levels were shown among groups，but the mRNA levels of TNFα in E2h，E2h+6，and E2h+24 were significantly higher than C.Conclusion：Increased mitochondrial O2—.during eccentric exercise and elevated H2O2 during respiratory burst can explain the biphasic nuclear import of NFκB during and after exercise respectively.

redox state；mitochondria；delayed onset muscle damage；respiratory burst；p65

G 804.2

A

1005-0000（2014）04-286-04

2014-04-05；

2014-06-28；录用日期：2014-06-29

天津市教委科研计划一般项目（项目编号：20080608）；天津体育学院博士科研启动项目

廖鹏（1969-），男，山东济宁人，博士，副教授，研究方向为运动氧化应激研究。

1.天津体育学院健康与运动科学系，天津 300381；2.天津体育学院研究生部，天津 300381；3.天津体育学院运动医学研究所，天津 300381。