郑淑芳 时丽芳 张益 何滔

胃与大肠腺癌中CXCL12和CXCR4蛋白的表达及相关性

郑淑芳 时丽芳 张益 何滔

目的 研究趋化因子（C－X－C chemokine ligand 12，CXCL12）及其受体（C－X－C chemokine receptor 4，CXCR4）蛋白在胃和大肠腺癌中的表达水平，探讨二者与胃和大肠腺癌发生、发展、浸润、转移的关系及临床意义。方法应用免疫组织化学方法检测胃腺癌、正常胃黏膜组织和大肠腺癌、正常大肠黏膜组织中CXCL12、CXCR4蛋白的表达情况，对其表达水平及其与临床病理的相关性做统计学分析。结果胃腺癌组织中CXCL12、CXCR4蛋白的阳性表达率均高于正常胃黏膜组织，差异均有统计学意义（P均＜0．01）；且二者的阳性表达为有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组，侵达浆膜层组高于侵达肌层组，差异均有统计学意义（P均＜0．05）。大肠腺癌组织中CXCL12、CXCR4蛋白的阳性表达率均高于正常大肠黏膜组织，差异均有统计学意义（P均＜0．01）；且二者的阳性表达为有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组，侵达浆膜层组高于侵达肌层组，差异均有统计学意义（P均＜0．05）。结论CXCL12和CXCR4在胃和大肠腺癌中高表达，可能与胃和大肠腺癌的发生、浸润、转移密切相关。

CXCL12；CXCR4；胃肠腺癌；浸润；转移

胃肠癌是消化道高发肿瘤，胃癌与大肠腺癌在全球的发病率居恶性肿瘤的第四位，病死率居第二位。我国是胃癌与大肠腺癌的高发区，随着饮食结构及环境因素的改变，近年来其发病率呈显著上升趋势［1］。尽管手术切除仍是目前首选的治疗手段，但术后的5年生存率早期癌可能达到85%～95%；而进展期癌一般只有30%左右，其死亡的主要原因是癌组织的广泛浸润和转移［1，2］。趋化因子（C－X－C chemokine ligand 12，CXCL12）及其受体（C－X－C chemokine receptor 4，CXCR4）作为趋化因子家族的重要成员，具有广泛的生物学作用，其在肿瘤浸润转移中的作用越来越受到人们的关注。本文研究通过免疫组化方法检测胃腺癌、大肠腺癌组织中CXCL12和CXCR4蛋白的表达情况，了解其浸润、转移相关的分子调控机制，以期对其进行早期干预，对提高胃肠道恶性肿瘤的疗效、降低其病死率具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 标本收集选取60例胃腺癌患者手术切除的胃腺癌标本，其中男性40例，女性20例，年龄24～89岁，中位年龄62岁；同期选取上述其中30例胃腺癌患者距癌组织5 cm以远的正常胃黏膜组织（经病理切片证实无增生性及肿瘤性病变）。60例大肠腺癌（包括结肠腺癌、直肠腺癌）患者手术切除的大肠腺癌标本，其中男性35例，女性25例，年龄35～84岁，中位年龄63岁；同期选取上述其中22例大肠腺癌患者距癌组织6 cm以远的正常肠黏膜组织（经病理切片证实无增生性及肿瘤性病变）。均立即固定于10%的中性缓冲福尔马林溶液中。所有病例术前均未行放疗、化疗。

1.2 主要试剂CXCL12兔抗人多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司（稀释度1∶100）；CXCR4兔抗人多克隆抗体购自美国R＆D公司（稀释度1∶50）；二抗（SP9001）及DAB均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 HE及免疫组织化学染色所取标本均经10%中性缓冲福尔马林液固定，石蜡包埋，每个蜡块行4 μm连续切片4张，其中1张进行HE染色，其余3张备做免疫组化检测。免疫组化采用SP两步法。具体染色方法按试剂盒说明书进行。实验中以PBS液代替一抗作为阴性对照，以试剂公司提供的阳性对照片作为阳性对照，同批次染色。

1.4 免疫组化结果判断CXCL12和CXCR4的阳性表达均于肿瘤细胞胞质中，呈黄色细颗粒状。阳性判断标准：每张切片于肿瘤区域随机选取10个高倍镜视野（避开大面积间质），分别按着色强度和着色细胞数赋分并求其均值，即按着色强度：所计数细胞无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色或金黄色为2分，棕褐色为3分；按阳性细胞所占百分比：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分。两者积分相加：≤2分者为阴性（－），≥3分者为阳性（＋）。

1.5 统计学处理使用SPSS 16．0统计软件进行统计学分析。计数资料的比较采用卡方检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXCL12和CXCR4蛋白在胃腺癌与正常胃黏膜组织中阳性表达率结果CXCL12和CXCR4蛋白在胃腺癌组织中阳性表达率均高于正常胃黏膜组织，且差异均具有统计学意义（P均＜0．01），见表1，图1～图4。

2.2 CXCL12和CXCR4蛋白在大肠腺癌与正常大肠黏膜组织中阳性表达率结果CXCL12和CXCR4蛋白在大肠腺癌组织中阳性表达率均高于正常大肠黏膜组织，且差异均具有统计学意义（P均＜0．01），见表2，图5～图8。

2.3 胃腺癌组织中CXCL12和CXCR4的蛋白表达与临床病理的关系如表3所示，胃腺癌组织中CXCL12和CXCR4的表达与癌组织浸润深度和淋巴结转移有关，即二者的表达水平在侵达浆膜组高于侵达肌层组、有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组，差异均有统计学意义（P均＜0．05）。

2.4 大肠腺癌组织中CXCL12和CXCR4的蛋白表达与临床病理的关系如表4所示，大肠腺癌组织中CXCL12和CXCR4的表达与癌组织浸润深度、淋巴结转移有关，即二者的表达水平在癌组织侵达浆膜层组高于侵达肌层组、有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组，差异均有统计学意义（P均＜0．05）。

表1 CXCL12和CXCR4蛋白在胃腺癌及正常胃黏膜组织中阳性表达率比较［n（%）］

表2 CXCL12和CXCR4蛋白在大肠腺癌及正常大肠黏膜组织中阳性表达率比较［n（%）］

图1 正常胃黏膜组织CXCL12免疫组化染色（×400）

图2 胃腺癌组织CXCL12免疫组化染色（×400）

图3 正常胃黏膜组织CXCR4免疫组化染色（×400）

图4 胃腺癌组织CXCR4免疫组化染色（×400）

图5 正常大肠黏膜组织CXCL12免疫组化染色（×400）

图6 大肠腺癌组织CXCL12免疫组化染色（×400）

图7 正常大肠黏膜组织CXCR4免疫组化染色（×400）

图8 大肠腺癌组织CXCR4免疫组化染色（×400）

3 讨论

CXCL12及其受体CXCR4作为趋化因子家族的重要成员具有广泛的生物学作用，其在肿瘤的浸润和器官特异性转移中的作用正倍受关注。通常二者以偶联分子对的形式参与细胞间信号传递及细胞迁移，故有人称其为CXCL12／CXCR4生物学轴。

表3 胃腺癌组织中CXCL12和CXCR4的蛋白表达与临床病理的关系［n（%）］

表4 大肠腺癌组织中CXCL12和CXCR4的蛋白表达与临床病理的关系［n（%）］

3.1 CXCL12／CXCR4与肿瘤发生本文研究应用免疫组化方法检测了60份胃腺癌、30份正常胃黏膜和60份大肠腺癌、22份正常大肠黏膜组织中CXCL12和CXCR4的蛋白表达情况，结果发现在胃腺癌组织、大肠腺癌组织CXCL12和CXCR4的阳性表达率分别高于正常胃黏膜组织和正常大肠黏膜组织，差异均具有统计学意义（P均＜0．01）。上述结果提示CXCL12和CXCR4可能与胃腺癌、大肠腺癌的发生有关。Ottaiano等［3］的研究报道也支持这一结果。CXCL12／CXCR4促进胃肠癌发生的机制可能与抑制细胞凋亡相关，即①CXCL12通过自分泌或旁分泌的形式分泌增加，刺激肿瘤细胞内CXCR4的高表达，进而促进p44／42 MAPK（ERK1／2）的活化，抑制促凋亡蛋白BAD（Bcl－xl／Bcl－2 associated death promoter）［4－7］或间接活化转录因子cAMP反应元件结合蛋白，上调抗凋亡基因Bcl－2的表达，从而抑制细胞凋亡［8］；②CXCL12可以抑制线粒体膜电位的升高、抑制细胞色素c从线粒体释放至胞浆，降低caspase－3的活性，抑制细胞凋亡［7］。③CXCL12与其受体CXCR4结合后，通过G蛋白激活细胞内蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），PKB能将促凋亡蛋白BAD磷酸化，抑制BAD活性，从而抑制细胞凋亡。

3.2 CXCL12／CXCR4与肿瘤的浸润、转移的关系本文研究应用免疫组化方法检测了60份胃腺癌和60份大肠腺癌组织中CXCL12和CXCR4蛋白的表达情况。结果显示CXCL12和CXCR4蛋白的阳性表达水平与患者的年龄、性别、分化程度均无关（P均＞0．05），而与癌组织浸润深度、淋巴结转移情况有关（P均＜0．05）。上述结果提示，CXCL12和CXCR4与胃和大肠腺癌的生物学行为密切相关，可能在胃和大肠腺癌的浸润、转移过程中发挥了重要的作用。Muller等［9］体外实验中用激光共聚焦显微镜观察到：20 s内，100 nmol／L的CXCL12可使乳腺癌细胞内的丝状肌动蛋白增加2．2倍，20 min后，乳腺癌细胞开始形成伪足，具有定向移动能力，从而证实了CXCL12／CXCR4轴与肿瘤细胞的运动、迁徙有关。以上结果提示，CXCL12／CXCR4生物轴活性增高促进胃和大肠腺癌的生长、浸润、转移的可能机制：①CXCL12／CXCR4的高表达并结合可能引起肿瘤细胞内骨架蛋白的聚合与再分布，提高了肿瘤细胞的运动能力，增加了肿瘤侵袭性。②CXCR4可调节细胞内钙离子浓度，活化细胞外信号调节激酶（ERK－1／2），并介导分泌基质金属蛋白酶（如MMP－2或MMP－9），降解IV型胶原纤维而破坏基底膜和诱发新生血管形成，重建肿瘤局部微环境，使之有利于癌细胞的生长、侵袭和转移［10，11］。③肿瘤细胞和肿瘤旁纤维母细胞分泌的CXCL12与由肿瘤细胞自主分泌或旁分泌的同源CXCR4受体的结合，可激活PI3K／AKT和MAPK p42／44信号转导通路，导致肿瘤细胞的增殖［12］，直接刺激肿瘤生长。Orimo等［13］比较研究了人乳腺癌中分离的肿瘤相关性成纤维细胞与正常乳腺分离的成纤维细胞培养分泌的CXCL12对乳腺癌细胞生长的影响，发现肿瘤相关性成纤维细胞分泌的CXCL12能显著地促进乳腺癌细胞的生长。④CXCL12／CXCR4可以上调血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA和蛋白水平的表达，促进肿瘤血管生成，有利于肿瘤细胞的繁殖。Liang等［14］利用siRNA沉默技术下调CXCR4表达后，可以明显抑制乳腺癌细胞株VEGF的生成，从而抑制肿瘤细胞的生长。

综上所述，CXCL12／CXCR4特异性结合能启动多条与肿瘤发生、发展、浸润、转移相关的信号转导通路，因此推测，沉默或阻断CXCL12／CXCR4生物轴是否可能成为肿瘤治疗的新靶点有待进一步深入研究。

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The expressions and correlations of CXCL12 and CXCR4 in gastrointestinal adenocarcinoma

ZHENG Shu－fang1，SHI Li－fang1，ZHANG Yi2，et al．1Department of Pathology，Affiliated Hospital of Logistics College of CAPF，Tianjin 300162，China2Postgraduate Training Basement in Affiliated Hospital of Logistics College of CAPF，Liaoning Medical College，Tianjin 300162，China

ObjectiveTo detect the expressions of CXCL12 and its receptor CXCR4 in gastrointestinal adenocarcinoma，and to evaluate their roles in carcinogenesis，development，infiltration and metastasis as well as their clinical significance．MethodsThe expressions of CXCL12 and CXCR4 protein were detected by SP immunohistochemical method in different tissues．The expression condition and there correlation with clinical pathology were analyzed statistically．ResultsThe positive expressions of CXCL12 and CXCR4 in gastric adenocarcinoma tissue both were higher than those of the normal gastric mucosa tissue，and the differences all had statistical significance（Pall＜0．01）．The positive expressions of CXCL12 and CXCR4 were closely correlated with metastasis of lymph node and depth of tumor infiltration in gastric adenocarcinoma group，and the differences all had statistical significance（Pall＜0．05）．The expressions of CXCL12 and CXCR4 proteins in the colorectal adenocarcinoma tissue were obviously higher than those of the normal colorectal mucosa tissue，and the differences all had statistical significance（Pall＜0．01）．The positive expressions of CXCL12 and CXCR4 were closely correlated with depth of tumor infiltration and metastasis of lymph node in colorectal adenocarcinoma group，and the differences all had statistical significance（Pall＜0．05）．ConclusionCXCL12 and its receptor CXCR4 may play an important role in tumorigenesis progression，infiltration and metastasis of gastrointestinal carcinoma．

CXCL12；CXCR4；Gastrointestinal adenocarcinoma；Infiltration；Metastasis

10.3969／j.issn.1674－7151.2014.02.003

2014－04－15）

（本文编辑：陈淑莲）

天津市应用基础及前沿技术研究计划面上项目（11JCYBJC13000）；武警后勤学院面上项目（WYMZ201009）

300162 天津市，武警后勤学院附属医院病理科（郑淑芳 时丽芳 何滔）

300162 天津市，辽宁医学院天津武警后勤学院附属医院研究生培养基地（张益）

郑淑芳，E－mail:zhengshf＠126.com