张莎莎崔 琳宰军华* 李 强，3路玲玲

（1 河南中医学院，河南 郑州，450008；2 河南中医学院第一附属医院，河南 郑州4500003 河南省病毒性疾病中医药防治重点实验室，河南 郑州450000）

PAI-1启动子序列与荧光素酶报告基因扩增及载体连接问题分析*

张莎莎1崔 琳2宰军华2* 李 强2，3路玲玲1

（1 河南中医学院，河南 郑州，450008；2 河南中医学院第一附属医院，河南 郑州4500003 河南省病毒性疾病中医药防治重点实验室，河南 郑州450000）

目的探讨纤溶酶原激活物抑制剂-1（Plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）启动子荧光素酶表达质粒构建中扩增、转化、酶切及连接的问题。方法利用PCR技术扩增1100 bp长度PAI-1启动子片段，与PUC-19T载体连接，将PUC19T-PAI-1 1100质粒，及荧光素酶报告基因pGL3-Basic质粒转染大肠肝菌（DH5a）后扩增，提取并纯化；以BglⅡ，MluⅠ酶切，电泳并回收PAI-1 1100片段和pGL3-Basic酶切大片段，将PAI-1 1100片段插入荧光素酶报告基因pGL3-Basic中，构建含PAI-1 1100片段荧光素酶质粒。结果扩增PAI-1 1100 bp片段成功，目的片段与载体PUC19T，pGL3-Basic载体连接条件较苛刻，需要增加连接时间及效率的摸索。结论 控制扩增时DNA浓度，胶回收，感受态质量，LB平板质量，内切酶，连接时间及质量比等问题都可增加连接成功概率。

PAI-1；启动子；荧光素酶报告基因；载体连接

基因重组技术是我们在分子生物学研究中较常使用到的基本技术，也是分子生物学实验的基础，它在现代中医药的研究中应用越来越广泛。载体构建是将外源性DNA目的片段通过重组技术转化入受体细胞中繁殖及表达，人工构建为需要的目的质粒，为进一步实验做基础[1，2]。当外源性DNA片段插入到相应载体内时，由于操作方法繁琐，所需时间长，人为性因素较大，容易导致实验难以继续。……