王海涛，王昌禄*，李贞景，陈勉华

（天津科技大学 食品工程与生物技术学院，天津 300457）

蓖麻饼粕是蓖麻籽榨油后的副产物，含有丰富的蛋白质和多种氨基酸及矿质元素[1-2]。蓖麻饼肥具有植物生长所需的氮、磷、钾3大元素，尤以氮肥效力最高[3]。蓖麻饼肥含碳水化合物多，纤维素在蓖麻饼粕中含量达到了30%以上[4]，发酵时能产热，会发热烧根、烧种[5-6]。在传统的有机肥堆制中，主要是利用原有的土著微生物进行自然发酵，生产周期长，营养元素损失严重，效果不理想[7]。针对这一问题，申建美等[8-12]分别利用不同方法选育了能加快有机物料降解的微生物，并进行了相关研究。在作物生长所需养分中，氮素可利用量的多少是限制作物生长的一个主要因素[13-14]，而有机肥与化学肥料相比的一个缺点就是肥效缓慢，不能满足前期作物对营养元素的需求[15]。蓖麻饼粕中的蛋白质含量丰富，具有提供高氮肥质量的潜力，直接施于农田，农作物无法吸收利用，经过微生物的分解作用，可将大分子蛋白质分解为多肽和游离氨基酸，易于被作物吸收利用。为高效利用蓖麻饼粕，采用生物技术手段，筛选出能够高效降解纤维素和蛋白质的微生物，添加到饼粕中进行发酵，达到缩短周期，减少营养素的损失，提高肥料利用率的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓖麻饼粕：山东某蓖麻榨油生产基地提供；麸皮：市售。

菌种：天津科技大学食品生物技术实验室保存的产纤维素酶菌株T1-2和产蛋白酶菌株P3-2。

种子液培养基：羧甲基纤维素钠（carboxy methylated cellulose-Na，CMC-Na）10g，蛋白胨3g，KH2PO44g，牛肉膏5g，MgSO4·7H2O 0.5g，水1 000mL。

固态发酵培养基：粉碎过40目筛的蓖麻饼粕8g，麸皮2g，MgSO4·7H2O 0.04g，CaCl20.02g，KH2PO40.04g，加6mL水搅拌均匀。

以上培养基灭菌条件为121℃、20 min。

水合茚三酮（分析纯）：天津市百世化工有限公司；3，5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）（分析纯）：天津市光复精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

HH-B11型电热恒温培养箱：天津市实验仪器厂；SP-2102UV型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；CL-32L型全自动智能高压蒸汽灭菌器：日本ALP公司；TDA8002型电热恒温水浴锅：天津市中环实验电炉有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 产淀粉酶测定试验

将菌种点接于产淀粉酶鉴定培养基上，30℃倒置于恒温培养箱中培养，待长出较大菌落后在其周围的培养基滴加少许碘液，以刚好均匀覆盖培养基表面为宜，观察菌落周围培养基有无颜色变化。

1.3.2 培养方法

将活化后的产纤维素酶菌T1-2和产蛋白酶菌P3-2接入液体种子培养基中30℃、180r/min摇床培养18h，加入固态发酵培养基中，搅拌均匀，静置培养，发酵结束后，饼粕在60℃条件下烘干至质量恒定，备用。

1.3.3 固态发酵条件的优化

分别设置不同发酵培养基含水量、发酵时间、菌种接种比例、接种量、发酵温度、pH值、麸皮含量，进行单因素试验，发酵结束时测定还原糖和游离氨基酸含量，并在单因素试验的基础上进行正交试验，以游离氨基酸含量为评价指标，以确定最佳发酵条件。

1.3.4 还原糖含量测定

取发酵后的饼粕样品少许，60℃烘干，研磨成粉末状，称取2.000g，加20mL自来水，30℃、180r/min摇床振荡1h，取5mL在4 000r/min条件下离心10min，上清液保存备用。

取4支25mL具塞比色管，1号管作为空白对照，各加入1mL蒸馏水，2、3、4号管中加入1mL待测液，1号管以1mL蒸馏水代替，每管均加入1.5mL 3，5-二硝基水杨酸试剂，将各管充分摇匀后在沸水浴中加热10min，取出冷却后用水用水定容至25mL。以1号管液为空白，在波长540nm处测定其吸光度值。根据3个吸光度值的平均值，在葡萄糖标准曲线上查出相应的还原糖含量，其计算公式：

1.3.5 游离氨基酸含量测定

取发酵后的饼粕样品少许，60℃烘干，碾磨成粉末状，称取0.400g，精确至0.001g。加50mL蒸馏水沸水浴10min，50℃下水浴保温30min，过滤，将滤液定容至100mL。混匀后吸取1mL滤液到20mL比色管中，加1mL蒸馏水，水合茚三酮3mL，0.1%抗坏血酸0.1mL，加塞，密封于沸水中加热15min，用冷水迅速冷却并不时摇动使加热时形成的红色被空气逐渐氧化褪去，待呈现兰紫色时，用体积分数为60%乙醇定容至20mL，摇匀，在波长570nm处测定其吸光度值。求3次重复的平均值，由标准曲线得知各样品的氨基酸含量，氨基酸含量计算公式：

2 结果与分析

2.1 产淀粉酶试验

按照1.3.1的方法，研究菌株T1-2和菌株P3-2有无淀粉酶活力。2株菌经30℃恒温培养箱中培养，待平板培养基上长出较大菌落后，滴加碘液，菌落周围没有出现透明圈，平板培养基上都是蓝色，说明2株菌都不产胞外淀粉酶。试验结果表明，用这2株菌混合发酵蓖麻饼粕后，饼粕中的还原糖含量的变化主要是由菌株T1-2产的纤维素酶降解纤维素及2株菌生长利用所致。

2.2 水分含量对发酵效果的影响

水分含量对发酵效果的影响见图1。

图1 水分含量对发酵效果的影响Fig.1 Effect of moisture on fermentation

由图1可知，在菌株T1-2和菌株P3-2混合发酵蓖麻饼粕中，水分含量的变化对发酵效果具有一定影响。随着水分含量的增加，游离氨基酸含量和还原糖含量都升高，在水分含量为40%时达到最高，之后随着水分含量的增加，游离氨基酸含量和还原糖含量逐渐降低。试验结果表明，水分含量为40%时最有利于发酵。

2.3 发酵时间对发酵效果的影响

发酵时间对发酵效果的影响见图2。

图2 时间对发酵效果的影响Fig.2 Effect of culture time on fermentation

由图2可知，不同发酵时间对菌株T1-2和菌株P3-2混合发酵蓖麻饼粕具有较大影响。其中，游离氨基酸含量随着发酵的进行，逐渐升高，并在第5天达到最高点，之后随着发酵的延长逐渐降低。还原糖含量则在第6天达到最高。前期游离氨基酸和还原糖含量的升高，可能是由于培养基中接种的产纤维素酶和产蛋白酶菌产生了作用。菌株T1-2分泌的纤维素酶分解固态培养基中的纤维素为还原糖，菌株P3-2分泌的蛋白酶分解固态培养基中的蛋白质为游离氨基酸，随着发酵的进行分游离氨基酸含量和还原糖含量别在第5天和第6天达到最大值，之后由于培养基环境的改变使产酶量降低，加上微生物的吸收利用，又使其的含量有所下降。试验结果表明，发酵5d时发酵效果最好。

2.4 菌种比例对发酵效果的影响

菌种比例对发酵效果的影响见图3。

图3 接种比例对发酵效果的影响Fig.3 Effect of inoculation proportion on fermentation

由图3可知，菌株T1-2和P3-2的菌种比例对发酵效果具有一定的影响。按1∶1的比例可使发酵效果最好，游离氨基酸和还原糖含量都最高，菌种比例的升高或降低都会使游离氨基氮及还原糖含量降低。

2.5 接种量对发酵效果的影响

接种量对发酵效果的影响见图4。

图4 接种量对发酵效果的影响Fig.4 Effect of inoculum on fermentation

由图4可知，在菌株T1-2和P3-2混合比例为1∶1的基础上，接种量对菌株T1-2和菌株P3-2混合发酵蓖麻饼粕具有一定影响。游离氨基酸和还原糖含量的变化趋势基本一致，混合菌种接种量为14%时发酵效果最好，游离氨基酸和还原糖含量都最高，接种量为7%时稍次之，接种量超过21%则会使游离氨基氮及还原糖含量降低。

2.6 温度对发酵效果的影响

发酵温度对发酵效果的影响见图5。

图5 温度对发酵效果的影响Fig.5 Effect of culture temperature on fermentation

由图5可知，温度对菌株T1-2和菌株P3-2混合发酵蓖麻饼粕具有较大影响。随着发酵温度的升高，游离氨基酸和还原糖含量都逐渐增加，其中游离氨基酸含量在35℃发酵时最高，还原糖含量在30℃发酵时最高，之后随着发酵温度的升高，游离氨基氮及还原糖含量都逐渐降低。试验结果表明，发酵温度为30℃时发酵效果最好。

2.7 pH值对发酵效果的影响

pH值对发酵效果的影响见图6。

图6 pH对发酵效果的影响Fig.6 Effect of pH value of substrate on fermentation

由图6可知，pH值对菌株T1-2和菌株P3-2混合发酵蓖麻饼粕具有一定影响。其中，在pH 3～5范围内，还原糖含量随着pH值的增加逐渐降低，从pH值为6开始，又逐渐升高。游离氨基酸含量随着pH值的增加逐渐升高，在pH值为4时达到最高，之后有所下降，从pH值为6开始又逐渐升高。试验结果表明，pH值为4时发酵效果最好。

2.8 麸皮含量对发酵效果的影响

麸皮含量对发酵效果的影响见图7。

由图7可知，游离氨基酸的含量随着麸皮含量的增加逐渐减少，而还原糖含量则随着麸皮含量的增加逐渐升高。原因可能是麸皮的添加增加的基质的透气性，有利于产纤维素酶菌T1-2分泌纤维素酶，进而降解较多的纤维素；而添加麸皮在增加透气性的同时也降低了底物的蛋白质含量，使得产蛋白酶产生菌可接触分解的蛋白质减少。麸皮营养成分很丰富，含有蛋白质、碳水化合物、维生素、多种矿质元素等成分，作为发酵基质麸皮在发酵培养时有许多的作用，可作为碳氮源发酵产酶，还可为菌株生长代谢提供微量元素和其他生长因子。综合考虑以上试验结果，麸皮含量为20%时发酵效果最好。

图7 麸皮添加比例对发酵效果的影响Fig.7 Effect of bran addition on fermentation

2.9 培养条件优化正交试验

在单因素试验的基础上，选出对发酵效果影响较大的4个主要因素：含水量A、接种量B、温度C、时间D，进行4因素3水平正交试验，测定其对游离氨基酸含量的影响及其最佳水平。培养条件优化正交试验结果见表1，方差分析结果见表2。

表1 培养条件正交优化试验结果及分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiment for fermentation conditions optimization

表2 正交试验结果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiment results

由表1和表2可知，4个因素中含水量对2株菌混合发酵饼粕后游离氨基酸含量影响最大，其次分别为接种量、温度、时间。正交试验极差分析得到的培养条件优化组合为A3B3C3D3，即含水量50%、接种量15%、温度36℃、时间7d。在此最佳培养条件进行验证试验，发酵后游离氨基酸含量为1.68%。

3 结论

利用菌株T1-2和P3-2混合发酵蓖麻饼粕，试验结果表明，2株菌都不产胞外淀粉酶。综合考虑游离氨基酸和还原糖含量2种指标，单因素试验结果为水分含量40%，发酵时间5d，菌种比例1∶1，接种量14%，发酵温度30℃，pH值为4，麸皮含量20%。但游离氨基酸含量的变化和还原糖含量的变化趋势不完全一致，以游离氨基酸含量为评价指标时，最优培养条件的优化组合为含水量50%、接种量15%、温度36℃、时间7d。在此最佳条件下，发酵后游离氨基酸含量为1.68%。

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