固相微萃取-气相色谱-质谱联用分析石菖蒲中挥发油成分

2014-04-12都姣娇杜安妮

中成药 2014年12期

关键词：石菖蒲挥发油质谱

都姣娇, 杜安妮

（1.北京市中西医结合医院, 北京 100039； 2.遵义医学院, 贵州遵义 563003）

固相微萃取-气相色谱-质谱联用分析石菖蒲中挥发油成分

都姣娇1, 杜安妮2

（1.北京市中西医结合医院, 北京 100039； 2.遵义医学院, 贵州遵义 563003）

目的研究固相微萃取法提取石菖蒲中的挥发油，并鉴定其挥发油的组成成分。方法优化固相微萃取条件，气相色谱-质谱联用技术对石菖蒲的挥发油进行成分鉴定并确定各成分的相对质量分数。结果采用固相微萃取法共提取出 33 个可鉴定成分，其中含有量较高的主要成分分别为 α-细辛脑（66.07%）、 2，4，5-三甲氧基-1-丙烯基苯（3.63%）、榄香素（2.65%）、毕橙茄烯（2.90%）等。结论固相微萃取-气相色谱-质谱联用法能快速、全面检测石菖蒲挥发油的主要成分，为其进一步研究提供了依据。

石菖蒲; 挥发油; 固相微萃取; 气相色谱-质谱联用

石菖蒲为天南星科多年生草本植物石菖蒲 Acorus tatarinowii Schott的干燥根，其味辛性温，具芳香之气，行散之力较强，为宣气通窍之佳品［1］。临床上主要用于热病神昏、癫狂、痰厥、健忘、痴呆、耳聋、耳鸣、心胸烦闷、跌打损伤等［2］。近年来研究发现，挥发油是石菖蒲镇静、催眠、抗惊厥［3］作用的主要有效部位，而细辛醚又是其主要活性成分［4］。 α-细辛醚具有解痉、抗惊厥和对戊巴比妥钠有协同等作用; 更有文献报道， β-细辛醚具有平衡大脑中枢神经系统兴奋和抑制的双重作用，有利于稳定临床癫痫病人的病情［5-6］。

对石菖蒲挥发油成分分析的文献报道大都集中在水蒸气蒸馏提取法和超临界二氧化碳流体萃取（SFE-CO2）法［7-8］，未查询到关于用固相微萃取-气相-质谱联用研究石菖蒲挥发油的相关报道。固相微萃取（SPME）的最大特点就是集取样、萃取、富集、进样于一体，因而操作简便，并且不需溶剂，萃取速度快、操作成本低、不污染环境、便于实现自动化［9-10］。本实验采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用（SPME-GC-MS）技术对石菖蒲挥发油成分进行分析鉴定，以期对其今后的相关研究提供参考。

1 仪器和试剂

手动固相微萃取装置（美国 Supelco公司）;HP-1510气相色谱顶空加热器（上海济成分析仪器有限公司）; 萃取纤维头分别为 100 μm聚二甲基硅氧烷涂层（PDMS）、 7 μm聚二甲基硅氧烷涂层（PDMS）、聚丙烯酸酯（PA）; 6890-5973N气相色谱-质谱联用仪（美国 Agilent公司） ; AL 204 电子天平（ Mettler Toledo公司） ;JS-05 多功能粉碎机（浙江武义捷顺工具有限公司）。

石菖蒲购自遵义医学院附属医院中药房，产地四川，经遵义医学院杨建文副主任药师鉴定为石菖蒲 Acorus tatarinowii Schott的干燥根。

2 实验方法

2.1 固相微萃取提取挥发油将石菖蒲置于 45 ℃烘箱中烘至恒定质量、粉碎、过 60 目筛。称取 0.4 g石菖蒲粉末置于 5mL样品瓶中，盖上瓶盖，在 120 ℃下平衡 20 min。萃取头使用前应先进行高温活化。将纤维头接上手柄后，萃取器插入样品瓶中，露出石英纤维进行萃取，相同温度下顶空萃取 25 min，然后将石英纤维退入针头，拔出萃取器，立即将萃取器插入 GC进样口（温度 260 ℃），露出石英纤维进行脱附，解吸 2 m in，最后石英纤维退入针头，拔出萃取器。

2.2 GC-MS 分析

2.2.1 色谱条件程序升温，初始温度 50 ℃，以 5 ℃/ min 的升温速率升至 125 ℃，保持 2 min，然后以 1 ℃ /min的升温速率升至 140 ℃，最后以 9 ℃/min 的升温速率升至230 ℃，保持 5 min; 汽化室温度 260 ℃;Agilent HP-5MS色谱柱（ 30m×0.25 mm×0.25 μm）; 载气为高纯氦气，体积流量 1.0mL/min。

2.2.2 质谱条件四极杆温度150 ℃; 电离方式 EI，电子能量 70 eV; 离子源温度 230 ℃; 溶剂延迟 4.0 min; 质量扫描范围 m/z30 ～500。

设定积分参数初始峰宽为 0.080，初始阈值为 16.0，采用峰面积归一化法计算各组分的相对质量分数，利用美国 Wiley7Nist05、 NIST05 两种质谱数据库的质谱数据进行计算机检索比对，对质谱图相似度大于 80%的化合物进行收集整理。

3 结果

3.1 固相微萃取条件的选择

3.1.1 纤维头选择选择 100 μm聚二甲基硅氧烷涂层（PDMS）纤维头和 7 μm聚二甲基硅氧烷涂层（PDMS）纤维头以及聚丙烯酸酯（PA）纤维头进行考察，按 “2.1”项所述实验步骤，以检测出的总峰面积和峰个数作为衡量指标，在相同积分参数条件下， 100 μm PDMS 共检出56 个峰，总峰面积为 1.008 ×109;7 μm PDMS 共检出 4 个峰，总峰面积为 5.237 ×107;PA共检出 31 个峰，总峰面积为5.228 ×108。结果证明， 100 μm PDMS 萃取头所得的峰面积总和及峰个数最大，说明其能够更有效地吸附石菖蒲中的挥发性成分，因此选用 100 μm PDMS 纤维头。

3.1.2 样品用量选择分别选用 0.2、 0.4、 0.6、 0.8 g样品粉末试验，考察色谱峰总面积和峰个数，在相同积分参数条件下，结果见图 1。结果表明，样品用量变化时，各种待测成分的峰面积变大或变小，而待测成分种类没有很大影响。样品用量为 0.4 g时，所得峰总面积已经达到最大，且峰分离度好、不拖尾。

图1 样品用量对总峰面积的影响

3.1.3 平衡时间选择保持其他条件不变，改变样品平衡时间从 15 min 延长至 35 min，考察平衡时间与总峰面积的关系。设定相同的积分参数条件，结果见图2。当平衡时间为 20 m in 时，总峰面积达到最大，之后随着时间的延长，总峰面积有所减少，说明 20 min 样品已达到考察条件内的最大值。因此选择 20 min 为样品最适宜平衡时间。

图2 平衡时间对总峰面积的影响

3.1.4 萃取温度选择分别选择 60 ～130 ℃ （每 10 ℃为一个温度梯度）作为参照，以色谱峰总面积和峰个数作为考察指标，结果见图 3。结果表明，随着萃取温度的上升，总峰面积也随之增加，当到达 120 ～130 ℃时，总峰面积达到动态平衡。并且考虑到萃取温度太高，萃取头的吸附量较大，记忆效应也较大，故选择 120 ℃为最适宜萃取温度。

3.1.5 萃取时间选择实验选定 10、 15、 20、 25、 30、35 min 萃取时间进行检测分析，以色谱峰总面积和峰个数作为考察指标，实验结果见曲线图 4。随着萃取时间的延长，总峰面积也随之增加，当萃取时间为 25 min 时达到最大值，之后总峰面积基本不变，说明此时分析组分的吸附与解析已达到平衡。因此，选择 25 min 作为最佳萃取时间。

图3 萃取温度对总峰面积的影响

图4 萃取时间对总峰面积的影响

3.1.6 解吸时间选择萃取头吸附样品之后插入气相色谱进样口进行解吸，若解吸时间过短，可能导致解吸不完全，会产生记忆效应，影响下一次测定;若解吸时间过长则会使进样时间变长，色谱峰则会变宽。合适的解吸时间能够保证萃取纤维上被富集吸附的待测成分更完全地解吸，防止在纤维涂层上残留。选定 1、 2、 3 min 进行解吸分析，实验结果表明， 2 m in 即可解吸完全。

3.2 重复性试验结果按 “2.1” 项下操作条件下，进行萃取进样分析，重复6次，在相同积分参数条件下，以石菖蒲挥发油成分的总峰面积值为考察指标，计算其 RSD，结果为 2.1%，表明该方法重复性良好，最佳萃取条件下的萃取量精确，适于石菖蒲挥发油成分的分析鉴定。

3.3 固相微萃取成分分析结果最优条件下固相微萃取得到的挥发油经 GC-MS 分析结果得到 34 个成分，其相对质量分数和为 86.99% （相似度 80%以上），总离子流图见图5，成分分析结果见表 1。

图5 固相微萃取石菖蒲挥发油总离子流图

4 结论

固相微萃取法收集的成分能比较真实地反映中药中的挥发性气味物质，固相微萃取技术是集取样、萃取、富集、进样于一身，大大缩短了操作时间（一般只需 0.5 ～1 h），一定程度上提高了分析灵敏度。石菖蒲挥发油经固相微萃取， GC-MS 分析，共有 33 种成分得到有效分离，相对质量

分数和为 86.99%。挥发油成分主要为结构通式为 C15H24和C12H16O3的化合物及其衍生物，其中相对质量分数较高的有 α-细辛脑（66.07%），细辛醚、 β-细辛醚均有镇静作用和抗惊厥作用， 2，4，5-三甲氧基-1-丙烯基苯（3.63%）、榄香素（2.65%）、毕橙茄烯（2.90%）等。采用 SPME萃取石菖蒲挥发油，最佳的萃取条件为 100 μm PDMS 纤维萃取头萃取，在 120 ℃下平衡 20min，吸附 25min， 260 ℃下解吸附 2 min。 SPME-GC-MS 技术能全面、快速地获得其组成信息，重复性好，且操作时间短，样品量小，无需萃取溶剂，可用于石菖蒲挥发油的快速检测、分析。