兰艳素, 李长江, 宋坤鹏, 管超建

（黄山学院化学化工学院, 安徽 黄山 245041）

星点设计-效应面法优化百蕊草总黄酮提取工艺

兰艳素, 李长江, 宋坤鹏, 管超建

（黄山学院化学化工学院, 安徽 黄山 245041）

目的 利用响应面分析法对百蕊草总黄酮的提取工艺进行优化。方法 在单因素试验基础上，确定乙醇体积分数、 液料比、 提取时间为 3 个自变量， 总黄酮得率为因变量， 通过星点设计-响应面法优化总黄酮提取工艺条件， 并进行预测分析。 结果 液料比和提取时间对百蕊草总黄酮的提取影响极显著， 最优提取工艺为 乙醇体积分数 70%，提取时间 40min， 液料比 20 ∶1 （ mL/g）。 在此条件下， 黄酮提取量达到 13.58mg/g。 结论 该方法合理、 简便、 快速，可预测性较优。

百蕊草;总黄酮;星点设计;响应面法

百蕊草为檀香科植物百蕊草 Thesium chinensis Turcz.的全草［1］， 又叫百乳草、 细须草、 地石榴等［2］， 多生于沙地草丛中或石坎边，我国南北各省区等地均有分布，而且产量较高［3］。 百蕊草最早载于 《 图经本草》， 味微涩苦， 性温， 常被称为 “ 植物抗生素”［4-5］， 是 我 国 民 间 常 用 中 药。具有很好的抗菌、消炎、解热、镇痛以及补气益肾等作用［6-7］， 临床上 经 常 用 于 治 疗 急 性 乳 腺 炎、 肾虚腰痛、 肺炎、乳痈、遗精、肺脓疡、黄疸、扁桃体炎以及各种上呼吸道感染等病症［8-10］。

百蕊草中含有的化学成分有黄酮、多糖、苷类、生物碱及矿质元素等， 其中黄酮类化合物的量最为丰富［11］。 到目前为止， 已经从百蕊草中分离得到 10 个黄酮类化合物［3，12］， 且所含的黄酮类化合 物 具有较好 的 抗 菌、 消炎活性［13］。 因此， 对百蕊草中总黄酮的研究具有重大意义。

本实验采用超声波辅助提取百蕊草总黄酮，在单因素试验基础上，以乙醇体积分数、液料比、提取时间为自变量，总黄酮得率为因变量，采用星点试验设计，通过效应面法进行数据分析，优化百蕊草总黄酮的提取工艺，以期为百蕊草的进一步开发利用提供参考依据。

1 材料与仪器

1.1 材料 百蕊草产于安徽， 购于亳州万生中药饮片有限公司， 批号 100601， 经生命与环境工程学院方建新老师鉴定为檀香科植物百蕊草的全草。 芦丁对照品 （批号 10080-200707， 购于中国药品生物制品检定所）; 乙醇购自黄山酒精厂;亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯;重蒸馏水自制。

1.2 仪器 UV-2100 型紫外可见分光光度计 （北京北分瑞利分析仪器有限公司）;KH-500B超声波清洗器 （昆山禾创超声仪器有限公司）;TG165 高速离心机 （长沙平凡仪器仪表有限公司）; 电子分析天平 （上海梅特勒-托利多仪器有限公司）;GZX-9030 MBE电热鼓风干燥箱 （上海博迅实业有限公司医疗设备厂）;FW100 型高速万能粉碎机 （天津市泰斯特仪器有限公司）。

2 方法

2.1 供试液的制备

2.1.1 芦丁对照品溶液的制备 将芦丁对照品置于真空干燥箱中， 在 105 ℃条件下干燥至恒定质量， 精密称取 12.5 mg干燥后的芦丁对照品于干净烧杯中， 用 60%乙醇溶解，转移至 50 mL量瓶中， 60%乙醇定容至刻度线， 摇匀即得芦丁对照品溶液， 该溶液质量浓度为 0.25 mg/m L， 备用。

2.1.2 百蕊草总黄酮的提取 称取干燥后的百蕊草粉末样品 1.0 g， 在 100 mL圆底烧瓶中， 分别在一定的乙醇体积分数、提取时间、液料比条件下，采用超声法辅助提取百蕊草总黄酮， 提取液冷却， 离心机低速离心 10 m in 后， 移取上层清液5mL置于50mL量瓶中， 乙醇定容刻度线， 作为待测溶液。

2.2 总黄酮定量测定

2.2.1 标准曲线的制作 分别精密移取 0.25 mg/mL芦丁对照品溶液 0.0、 0.5、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0 mL， 置于 25 mL量瓶中， 分别加 60%乙醇至 6 mL， 加入 5%亚硝酸钠溶液 1.0 mL， 摇匀， 放置 6 min， 然后加入 10%硝酸铝溶液 1.0mL， 摇匀后放置 6min， 再加 4%的氢氧化钠溶液 10 m L， 最后用 60%乙醇溶液定容至刻度线， 摇匀， 放置 15 m in， 以空白液作参照， 在 510 nm波长处测定吸光度值［14］。 制作芦丁标 准 工作曲线， 得 线性回归 方 程:y= 10.107x+0.045 9， r2=0.999 7， 线性关系良好。

2.2.2 样品中总黄酮量的测定 用移液管移取 5.0 mL待测液于25 mL量瓶中， 按 “2.2.1” 项下的操作方法， 分别加入亚硝酸钠、 硝酸铝和氢氧化钠， 静置 15 min 后在 510 nm处测定提取液的吸光度 A值， 由标准曲线方程计算得出样品溶液的质量浓度，再计算出样品中总黄酮的量。计算公式为: 样品中总黄酮量 （以芦丁计）

式中:Y为黄酮提取量 （mg/g）;A为吸光度;V为离心之后的上清液体积 （mL）;m为样品质量 （g）。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 精密移取 0.25 mg/mL芦丁对照品溶液 1.0mL于 25mL量瓶中， 按照 “2.2.1” 项下方法测定溶液在510 nm处的吸光度值。 结果 RSD为1.2% （n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取制备好的百蕊草提取液 1.0 mL，置于25 mL量瓶中， 按 “2.2.1” 项下方法操作， 显色后每隔 15 min 测定溶液在 510 nm处的吸光度值。 实验结果显示， RSD为 1.1% （n=6）， 表明供试品溶液在 1.5 h 内稳定。

2.3.3 重复性试验 移取制备好的百蕊草提取液 6 份， 每份 1 mL， 按照 “2.2.1” 项下方法测定溶液在 510 nm处的吸光度值， 结果 RSD为 1.0%， 表明方法重复性良好。

2.3.4 加样回收率试验 精密量取已知总黄酮量的百蕊草提取液 6 份， 再分别加入 0.25 mg/mL芦丁对照品溶液 1.0 mL， 按照 “2.2.1” 项下方法测定溶液在 510 nm处的吸光度值， 计算回收率， 平均回收率为 99.9%， RSD为 1.1%。

2.4 单因素试验

2.4.1 称取百蕊草粗粉 6 份， 每份1.0 g， 分别加入20mL体积分数分别为 40%、 50%、 60%、 70%、 80%和 90%的乙醇溶液， 在温度为 60 ℃条件下提取 30 min， 提取液按“2.2.1” 项下的操作方法显色后测定溶液吸光度值， 并计算总黄酮量。

2.4.2 称取百蕊草粗粉 5 份， 每份 1.0 g， 分别加入 70%乙醇溶液 20 mL， 温度为 60 ℃条件下分别提取 20、 30、40、 50 和 60 min， 提取液按 “2.2.1” 项下的操作方法显色后测定溶液吸光度值，并计算总黄酮量。

2.4.3 称取百蕊草粗粉 5 份， 每份 1.0 g， 分别加入 10、15、 20、 25、 30、 35mL 70%乙醇溶液， 温度为 60 ℃条件下提取 40 min， 提取液按 “2.2.1” 项下的操作方法显色后测定吸光度值，并计算总黄酮量。

3 结果

3.1 单因素试验结果

3.1.1 乙醇体积分数对百蕊草总黄酮提取率的影响 由图1可以看出，乙醇体积分数较低时，总黄酮的提取率很小，随着乙醇体积分数的升高，总黄酮的提取率逐步增加，当乙醇体积分数为 70%时， 总黄酮的提取率达到最大值， 乙醇体积分数高于 70%时， 黄酮的量开始下降。 因此， 确定乙醇体积分数为 70%。

图1 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响

3.1.2 提取时间对百蕊草总黄酮提取率的影响 由图 2 可知，提取时间很短时，黄酮得率较低，随着提取时间的延长， 总黄酮提取量逐渐增加， 当提取时间为 40 min 时达到最大值。 40 min 后， 百蕊草总黄酮量趋于稳定， 故提取时间选取 40 min。

图2 提取时间对黄酮提取率的影响

3.1.3 液料比对百蕊草总黄酮提取率的影响 由图 3 可见， 当液料比为10∶1 时， 黄酮得量很低， 之后快速增加，在 15 ∶1 到 30 ∶1 之间变化时， 黄酮提取率的变化不大，当液料比为20 ∶1 时提取率达到最大值， 原因可能是溶剂量越多，药材和溶剂的接触越充分，提取量呈上升趋势，但是当溶剂达到一定量之后，再增加溶剂的量，对提高黄酮得率也没有太大帮助，由于加大溶剂的量，会提高提取的成本， 因此， 液料比选 20 ∶1。

图3 液料比对黄酮提取率的影响

3.2 星点设计试验

3.2.1 实验设计与结果 在单因素试验所得数据的基础上，根据星点实验设计原理，以百蕊草总黄酮得率为响应值，乙醇体积分数、液料比和提取时间为考察因素，分别用 X1、 X2、 X3表示， 每个因素设五水平， 并以 1.73、 1、0、 -1、 -1.73 表示自变量的高低水平， 各因素水平编码见表 1。 星点实验设计及结果见表 2。

表1 因素水平

表2 实验设计与结果

3.2.2 模型拟合 以总黄酮提取率为响应值， 采用 Design Expert软件对试验结果进行回归分析， 得到乙醇体积分数、提取时间和液料比对总黄酮提取率影响的二项式方程，拟合后，得到回归模型方程为:

对该模型进行回归方差分析和显著性检验，结果见表3。

由表 3 可知， 该模型 P＜0.000 1， 表明实验所得的回归模型方程极显著。在本实验设定的区域范围内，液料比和提取时间的 P值均小于 0.000 1， 对总黄酮得率的影响极显著， 乙醇体积分数 P值小于 0.01， 影响显著， 总的来说，各因素对响应值的影响顺序为:液料比＞提取时间＞乙醇体积分数。

表3 响应面分析试验方差分析结果

交互项中乙醇体积分数与提取时间的交互作用对总黄酮得率的影响极显著，乙醇体积分数与液料比次之，液料比和提取时间的交互作用对总黄酮得率不明显，即在提取过程中，总黄酮得率可以忍受液料比和提取时间的微小变化，而不至于产生较大的影响。二次项中均小于 0.000 1， 对响应值的影响都极显著， 所以乙醇体积分数、液料比和提取时间对总黄酮提取率的影响并非简单线性关系，而应该是二次曲线关系。

方程的失拟项 P值为 0.337 3， 失拟项不显著， 说明其他未知因素对试验结果的影响较小，拟合检验极显著。所以，该方程与实际情况拟合很好，能够较好地反映百蕊草总黄酮提取率与乙醇体积分数、液料比、提取时间的关系，可对百蕊草总黄酮的提取工艺参数进行较好预测。

3.2.3 效应面优化和预测 根据回归方程， 利用 Design-Expert软件， 绘制得到交互作用影响比较显著的三维效应曲面， 见图 4、 图 5。

图4 提取时间与乙醇体积分数交互影响黄酮得率的响应面图

由图4可见，当液料比一定，乙醇体积分数与提取时间的交互作用影响显著，随着提取时间延长和乙醇体积分数的增大，总黄酮提取率都呈现先增加后减少的趋势，而且乙醇体积分数在 60% ～80%之间变化时， 总黄酮得率的变化范围较大，即乙醇体积分数对总黄酮得率的影响比液料比大。

图5 液料比与乙醇体积分数交互影响黄酮得率的响应面图

由图5可见，液料比与乙醇体积分数的交互作用影响曲面开口往下，曲面较陡峭，影响显著。总黄酮得率随着乙醇体积分数、液料比的增大而增加，并分别在液料比为20 ∶1 （m L/g）、 乙醇体积分数为 70%附近出现最高点， 之后开始降低，且乙醇体积分数降低的程度更大一点，说明乙醇体积分数对响应值的影响比液料比强。

总体来看，乙醇体积分数是3个因素当中对总黄酮提取率的影响最显著。对回归模型进行分析，黄酮提取率最大预测值为 13.58mg/g， 最优提取工艺条件为: 乙醇体积分数 70.19%， 提 取 时 间 42.10 min， 液 料 比 18.83 ∶1（mL/g）。

3.3 验证试验 为了检验该模型的准确度， 对模型优化得到的最优工艺结果做验证性试验，从具体操作条件来考虑，将工艺条件修正为乙醇体积分数 70%， 提取时间 40 min，液料比 20 ∶1 （mL/g）， 在该条件下， 做 5 次平行试验。 验证试验测得总黄酮的平均得率为 13.76 mg/g， 相对误差1.6%， 与预测值基本一致， 说明该模型与实际试验点拟合较好，模型方程可靠、实用。因此，基于星点设计所得的最佳工艺参数准确可靠，具有实用价值。

4 讨论

正交设计法、均匀设计法经常被应用于中药有效成分的提取工艺研究，虽然以上两种方法的试验次数少，但在设定的实验区域内，很难找到一个明确的函数式来表达各因素和响应值之间的关系，所以也就无法找到整个区域上考察因素的最佳组合，并对响应值的最优值进行预测。星点设计-响应面优化法可以弥补以上不足， 采用非线性数学模型拟合，并在中心点进行重复性试验，可以提高实验精确度。 所以实验采用星点设计-响应面优化法对百蕊草总黄酮提取工艺进行了研究，该法简便、稳定。

本实验在单因素试验基础上，以乙醇体积分数、提取时间、液料比为自变量，总黄酮得率为因变量，采用星点试验设计，效应面法进行分析，得到超声波法辅助提取百蕊草总黄酮的最佳工艺条件为 70%乙醇提取， 提取时间40 min， 液料比 20 ∶1 （ m L/g）， 此条件下总 黄酮得 率为13.58 mg/g。

［1］ 罗夫来，郭巧生.百蕊草矿质元素含量测定和主成分分析［ J］ .中国中药杂志， 2010， 35 （10）:1226-1230.

［ 2 ］ 路 锋， 赵稳操， 贾艳星， 等.百蕊草属药学研究概况［J］.安徽农业科学， 2011， 39（31）:19091-19092.

［ 3 ］ 鲁云霞， 汪俊松.百蕊草的化学成分研究［J］.中草药，2004， 35（5）:491-492.

［4］ 储晓琴，胡叶青，岳 磊.大孔吸附树脂纯化百蕊草总黄酮工艺研究［J］.中药材， 2013， 36（3）:478-481.

［5］ 罗夫来， 郭巧生，王长林， 等.寄主对半寄生植物百蕊草影响的综合评价研究［ J］.中国中药杂志， 2012， 37（9）: 1174-1179.

［6］ 钟方丽，王晓林，纪萍萍，等.百蕊草中总黄酮的提取工艺研究［ J］ .吉林化工学院学报， 2008， 25（4） :5-7.

［ 7 ］ Parveen Z， Deng Y L， Saeed M K， etal.Antiinflammatory and analgesic activities of Thesium chinense Turcz extracts and its major flavonoids， kaempferol and kaempferol-3-O-glucoside［ J］ .Yakugaku Zasshi， 2007， 127（8）:1275-1279.

［ 8 ］ 唐慧文， 宋晓宁， 骆红梅.HPLC法测定百蕊草中山奈酚的含量［J］.贵阳中医学院学报， 2006， 28（4）:60-61.

［9］ 徐国兵，黄万著，王德群，等.百蕊草药材中山奈酚和总黄酮的含量测定［ J］.中医药学报， 2008， 36（1） :39-41.

［10］ 储晓琴， 岳 磊， 胡叶青， 等.正交设计优选百蕊草的提取工艺［J］.安徽中医学院学报， 2013， 32（2）:80-82.

［11］ 王 峥， 李绍顺.百蕊草药材及其制剂中总黄酮的含量测定研究［J］.中成药， 2007， 29（1）:138-139.

［12］ 刘 洋， Zahida P， 邓玉林， 等.百蕊草中黄酮类化合物研究［J］.中草药， 2009， 32（4）:518-520.

［13］ 刘永松， 潘 玲， 祁克宗， 等.百蕊草有效提取成分对七种细菌的敏感性试验［J］.贵州医药， 2006， 30（6）:564-566.

［14］ 田宝成， 贾昌平， 杨军涛， 等.Box-Behnken 效应面法优化红旱莲总黄酮提取工艺的研究［J］.中成药， 2010， 32（3）: 389-392.

R284.2

:B

1001-1528（2014）12-2629-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.044

2013-10-23

安徽高校省级优秀青年人才基金重点项目 （2013SQRL088ZD）; 安徽省高校省级自然科学研究项目 （KJ2011B168）; 黄山学院自然科学基金项目 （2011xkj017）

兰艳素 （1985—）， 女， 硕士， 助教， 从事天然产物提取分离与活性研究。 Tel:13685595775， E-mail:ls7536858@163.com