智康康, 杨中铎, 舒宗美

（兰州理工大学生命科学与工程学院, 甘肃 兰州 730050）

[成分分析]

藏药萨折抗单胺氧化酶活性成分研究

智康康, 杨中铎*, 舒宗美

（兰州理工大学生命科学与工程学院, 甘肃 兰州 730050）

目的 分离鉴定藏药萨折中的单胺氧化酶抑制剂。 方法 运用硅胶、 聚酰胺、 凝胶柱色谱和 HPLC分离纯化萨折的化学成分， 并根据其理化性质和波谱数据鉴定化合物结构。 采用 Holt法进行抗单胺氧化酶活性测定。 结果 从萨折的乙醇提取物 中 分离得到 3 个化 合 物， 分别 鉴 定为没食子 酸 （1）， 没食子酸 甲 酯 （ 2）， 3，4，8，9，10-pentahydroxydibenzo［ b，d］ pyran-6-one（3 ） 3 个化 合 物。 其对 单 胺 氧 化酶 的 半 数 抑 制 浓 度 （ IC50） 分 别 为 10.0、 35.9、35.2 μmol/L。 结论 化合物 3 为首次从萨折中分离得到， 化合物 1 ～3 均具有较强单胺氧化酶抑制活性， 其中化合物1 活性最好， 其 IC50为 10.0 μmol/L。

萨折;化学成分;单胺氧化酶抑制剂

萨折为一种常用藏药，在我国藏区主要用于肾脏病和三灾病的治疗，其基源植物为海南蒲桃Syzygium cumini（ Linn.） Skeels的果实。 该植物性向阳，喜温暖湿润气候，适生性强，分布较广，产于云南、福建、广东、广西;生于低海拔疏林中或旷野［1］。 单胺氧化酶是一种存在于线粒体外膜的氧化还原酶，通过催化内源性和外源性单胺类物质的代谢，使其失去生理活性，而控制机体内胺类物质的水平［2］。 目前研究表明单胺氧化酶抑制剂是治疗和改 善抑郁 症以及帕金 森 病 的有效药物［3］。本实验采用 Holt法［4］在对藏药总有机酸提取物抗单胺氧化酶活性筛选的时候，发现萨折提取物具有显著的单胺氧化酶 （MAO） 抑制活性， 其半数抑制质量浓度 （ IC50） 为 6.06 μg/mL。 本研究对其中的 MAO抑制剂进行了分离纯化和结构鉴定，以期为萨折的深度开发提供依据。

1 材料

Bruker-400 型核磁共振波谱仪 （ 德国 Bruker公司，1H-NMR 400 MHz，13C-NMR 125 MHz）;LC-2000 型半制备高效液相色谱工作站 （日本分光株式会社）， Polaris C18色谱柱 （ 4.6 mm×250 mm），微量进样器; 硅胶 （200 ～300 目， 青岛海洋化工厂），sephadex LH-20 （ Pharmacia公 司），聚 酰 胺（100 ～200 目， 路桥四甲生化塑料厂）; 薄层层析硅胶 （ GF254， 青岛海洋化工厂）;HH-2 数显恒温水浴锅 （江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）; RE-5286A型旋转蒸发仪 （上海亚荣生化仪器厂）。所有溶剂为分析纯。

萨折药材购自西宁八一药材市场，经兰州理工大学杨林副教授鉴定为海南蒲桃 Syzygium cumini（Linn.） Skeels的果实。

氯吉林购自 Sigma公司。 酪胺、 帕吉林盐酸盐、磷酸异丙烟肼、 香草酸、 辣根过氧化酶 （Ⅱ型）、 4-氨基安替吡啉等购自阿拉丁试剂有限公司。

2 方法

2.1 提取与分离 将干萨折 （5 kg） 粉碎， 用95%的工业乙醇提取， 回流提取 2 次， 每次 2 h，抽滤，减压浓缩至浸膏，回收乙醇，再将浸膏悬浮于 5 L蒸馏水中， 用 4 mol/L NaOH调悬浮水溶液至 pH为 10 ～11， 静置过夜; 抽滤; 再用 2 mol/L HCl溶液调 pH为 2 ～3， 用乙酸乙酯等体积萃取，减压浓缩，回收乙酸乙酯，得萨折总有机酸。

将萨折总有机酸进行聚酰胺 （100 ～200 目）柱色 谱 分 离， 依 次 以 水 和 30%、 50%、 70%、90%甲醇梯度洗脱， 弃去水洗脱部分， 30% ～90%甲醇洗脱部分，TLC跟踪合并，得到 6 个部分（Fr.1 ～Fr.6）。 测定 Fr.1 ～Fr.6 的单胺氧化酶抑制活性， 发现组分 Fr.1 以及 Fr.3 具有显著活性，其 IC50分别为 0.3、 11.3 mg/L。 Fr.1 经硅胶柱色谱， 三氯甲烷-甲醇 （20 ∶1 ～1 ∶1） 分离得到 Fr. 1a～Fr.1c;Fr.1c经过 LH-20 柱色谱甲醇洗脱纯化， 得到化合物 1 （120 mg）。 Fr.3 经聚酰胺柱色谱， 丙酮-甲 醇 （40 ∶1 ～1 ∶1） 梯 度 洗 脱 得 到Fr.3a～Fr.3e，分别对 Fr.3a与 Fr.3c进行 HPLC分离， 甲醇-水 （30 ∶70 ～80 ∶20，含有 0.1%三氟乙酸） 洗脱， 最后用 LH-20 柱色谱， 甲醇洗脱纯化，得到化合物 2 （10 mg）， 化合物 3 （150 mg）。

2.2 单胺氧化酶抑制活性的测定 本实验采用改进的 Holt方法评价单胺氧化酶抑制活性， 其中磷酸异丙烟肼作为阳性药，每个实验重复3次。

反应孔: 在 96 孔酶标板孔中加入 40 μL酶溶液 （每 1 mL含有 0.5 mg蛋白质，由 Bradford［5］法测定），40 μL待测样品， 混匀后在 37 ℃培养20 min， 取出后再加入 120 μL酪胺 （5 mmol/L），40 μL显色剂 （1 mmol/L香草酸， 0.5 mmol/L 4-氨基安替吡啉和4 U/mL辣根过氧化酶的混合液），在 37 ℃培养 1 h， 在 490 nm读取吸光值 （以上均用 0.2 mol/L， pH7.6 磷酸缓冲液配制）。 空白孔:用 40 μL缓冲液代替待测样品， 其他不变。 空白阴性孔: 用120 μL缓冲液代替底物酪胺， 其他不变。样品对照孔: 用 120 μL缓冲液代替底物酪胺， 其他不变。由以上则可计算出抑制率，公式:

其中化合物1、 2、 3 根据实验的摸索， 最终测定 IC50值时选择 6 个质 量浓度， 化合物 1 为 40、30、 25、20、 15、 10 μg/L， 化合物 2 为 140、 120、100、 80、 60、 40 μg/L， 化合物 3 为 100、 80、 60、50、 40、 20 μg/L。 IC50值通过 Grafit5 计算获得。

为了测定 MAO-A的抑制活性， 需要在酶液中加入对应体积的 500 nmol/L的帕吉林溶液 （选择性单胺氧化酶-B抑制剂）预孵 30 min， 去完全抑制单胺氧化酶-B， 再进行测定。 反之， 亦然 （氯吉灵为选择性单胺氧化酶 -A抑制剂）。

3 结果

3.1 结构鉴定

化合物 1: 白色针状结晶 （甲醇）， 与没食子酸对照品进行薄层色谱对比试验， Rf值一致， 混合熔点 不 下 降。1H-NMR （ CD3OD， 400 MHz） δH: 7.07 （2H， s， H-2， H-6 ）， 其 氢 谱 数 据 与 文 献［6］ 一致，故鉴定为没食子酸。

化合物 2: 无色颗粒状结晶 （甲醇），1H-NMR（CD3OD， 400MHz） δH:7.03 （2H， s，H-2，6），3.80 （3H， s， OCH3 ）。13C-NMR （ CD3OD，125 MHz） δC:169.0 （C-7） ， 146.5 （C-3， 5）， 139.7（ C-4 ）， 121.4 （ C-1 ）， 110.1 （ C-2， 6 ）， 52.2（C-8）。 以上数据与文献 ［7］ 一致， 故鉴定为没食子酸甲酯。

化合 物 3: 黄 绿 色 粉 末，1H-NMR （ CD3OD，400 MHz） δH:8.44 （1H， d， J=9.2 Hz， H-1），7.37 （1H， s， H-7 ） ， 6.76 （ 1H， d， J=9.2Hz，H-2 ）。13C-NMR （ CD3OD， 125 MHz） δC:163.9（C-6）， 146.8 （C-3）， 146.5 （C-8）， 144.1 （C-10）， 142.4 （ C-9 ），141.0 （C-4a），133.3 （ C-4）， 119.1 （ C-1 ）， 118.5 （ C-10a） ， 112.9 （ C-10b）， 112.4 （ C-2 ）， 111.7 （ C-6a）， 108.1 （ C-7）。 以上数据与文献 ［8］ 一致， 故鉴定为 3，4，8，9，10-pentahydroxydibenzo［b，d］ pyran-6-one。

3.2 化合物的单胺氧化酶抑制活性 结果表明化合物 1、 2、 3 均具有 MAO抑制活性 （见表 1）， 且均具有较强的总 MAO抑制活性， 但对 MAO-A和MAO-B均无明显选择性。 其中化合物 1 的 MAO-B的 IC50值 5.9 μmol/L小于阳性药的 9 μmol/L。

表 1 化合物1 ～3 抑制单胺氧化酶的活性Tab.1 Inhibitory activities of com pounds 1-3

4 讨论

已有对萨折的研究主要在以下几个方面:其化学成分的研究集中在花青素，果色素，黄酮与木脂素葡糖苷方面［9-12］; 其提取物对细胞砷中毒有明显的缓解作用，可考虑将其用于治疗砷中毒相关疾病［13］; 其原花青素具有较强的清除自由基与抗氧化活性等 体 外活 性［14-15］; 其 种子 提 取 物具 有 促 进胰岛细胞生成和胰岛素分泌的作用［16-18］。 此前尚未见有报道过其具有抗单胺氧化酶活性，本研究发现萨折提取物具有显著的抗单胺氧化酶活性。

没食子酸是多种中药中的活性成分，具有抗炎、 抗突变、 抗氧化以及抗肿瘤等生物学效应［19］，但到目前为止未见没食子酸抗单胺氧化酶活性的报道。 本研究发现没食子酸类化合物 1、 2均具有显著抗单胺氧化酶活性。化合物2由于比1结构中多一个甲氧基，活性大幅下降，这说明没食子酸的羧基被酯化后，活性会下降。

化合物3属于鞣花酸类化合物，此类化合物具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌及增强免疫作用等多种生物活性［20-22］， 但到目前为止， 未见这类化合物抗单胺氧化酶活性的报道。其作为先导物，经过修饰改造后，有望能得到抗单胺氧化酶活性高的化合物。

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M onoam ine oxidase inhibitors from Syzygium cum ini（Linn.） Skeels

ZHIKang-kang， YANG Zhong-duo*， SHU Zong-mei
（ School of Life Science and Engineering， Lanzhou University of Technology， Lanzhou 730050， China）

AIM To studymonoamine oxidase inhibitors from Syzygium cumini（ Linn.） Skeels.METHODS The compounds were isolated and purified by various column chromatographic techniques and their structures were elucidated on the basis of spectral analysis（ EI-MS，1H-NMR，13C-NMR）.RESULTS Three compounds were isolated and identified as gallic acid （1） ， methyl gallate（2 ） and 3 ，4，8，9 ，10-pentahydroxydibenzo［ b，d］pyran-6-one（3）.CONCLUSION Compound 3 is obtained from this plant for the first time.Compound 1 shows significant inhibitory activities against themonoamine oxidase with IC50values of10.0 μmol/L.

Syzygium cumini（ Linn.） Skeels;chemical constituents;monoamine oxidase inhibitor

R284.1

:A

1001-1528（2014）12-2547-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.022

2013-11-06

国家自然科学基金资助项目 （21262022）; 浙江省自然科学基金资助项目 （LY12B02005）; 兰州理工大学红柳杰出人才资助项目 （J201303）

智康康 （1989—）， 男， 硕士生， 从事天然药物化学方面的研究。 Tel:15294227531， E-mail:sqyjktwzkk@163.com

*通信作者: 杨中铎 （1976 —） ， 男， 教授， 博士， 从事 天然 药物 化学方 面的 研究。 Tel: （ 0931 ） 2976703， E-mail:yangzhongduo@ 126.com