王鼎峰, 胡 冰, 王荔青

（福建省莆田市药品检验所, 福建 莆田 351100）

HPLC法测定丹灯通脑胶囊中阿魏酸、 丹酚酸 B、 葛根素、 野黄芩苷

王鼎峰, 胡 冰, 王荔青

（福建省莆田市药品检验所, 福建 莆田 351100）

目的 建立 HPLC同时测定丹灯通脑胶囊 （丹参、 灯盏细辛、 川芎、 葛根） 中阿魏酸、 丹酚酸 B、 葛根素与野黄芩苷的方法。 方法 丹灯通脑胶囊甲醇提取液的测定， 采用岛津 LC-2010AHT高效液相色谱仪， 色谱柱为 Thermo Hypersil GOLD C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm） ， 梯度洗脱、 双波长检测 （0 ～10 m in， 250 nm;10 ～35 min， 336 nm）的方法。 结果 阿魏酸、 丹酚酸 B、 葛根素、 野黄芩苷的线性范围分别为 3.045 ～60.90 μg/mL（r=0.999 6）、 82.78～1 655.5 μg/mL（r=0.999 7）、 28.64 ～572.80 μg/mL（r=0.999 8） 和 31.725 ～634.50 μg/mL（r=0.999 7）; 平均回收率 （n=9） 分别为 100.2% （RSD为 0.5%）、 100.0% （RSD为 0.7%）、 99.8% （RSD为 0.8%） 和 100.0%（RSD为 0.7%）。 结论 本方法是对现行的两个质量标准 （只对其单一组分进行测定） 的改进。

丹灯通脑胶囊;阿魏酸;丹酚酸B;葛根素;野黄芩苷;高效液相色谱法

丹灯通脑胶囊是由丹参、灯盏细辛、川芎、葛根四味中药经加工提取制成的中药成方制剂，收载于 《国家中成药标准汇编》［1］和国家食品药品监督管理局局颁药品标准［2］， 该药品具有活血化瘀、 祛风通络之功效。本实验参考相关文献，采用高效液相色谱法，应用梯度洗脱、切换波长等方法，测定该药品处方中川芎和丹参的有效成分阿魏酸与丹酚酸B，以及葛根和灯盏细辛的有效成分葛根素与野黄芩苷的量，实验结果表明所用方法操作简便、专属性好、快捷准确，可用于该制剂的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津 LC-2010AHT高效液相色谱仪，UV-VIS 检测器， LC solution 色谱工作站 （ 日本岛津制作所）;UV-2450 型紫外分光光度计 （日本岛津制作所）;CPA 224S 型分析天平 （赛多利斯科学仪器 ［ 北 京］ 有限公司） ;Elmasonic S150 实 验室应用型超声波清洗器 （ 德国 Elma公司） ;80-2型离心沉淀器 （上海手术器械厂）。

1.2 试药 阿魏酸对照品 （批号 110773-201313，纯度 99.6%）、 丹酚酸 B对照品 （ 批号 111562-201212， 纯 度 95.4%）、 葛 根 素 对 照 品 （ 批 号110752-200912， 纯度 96.0%）、 野黄芩苷对照品（批号 110842-200403，纯度 97.12%）， 均购自中国食品药品检定研究院; 丹灯通脑胶囊 （云南施普瑞生物工程有限公司生产，批号分别为C1713004、 C1713016、 C1713020）; 乙腈、 甲醇为色谱纯;磷酸为分析纯;水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 HPLC法同时测定阿魏酸与丹酚酸 B

2.1.1 色谱条件 以 Thermo Hypersil GOLD （C18）柱为色谱柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）; 甲醇为流动相 A， 0.2%磷酸水溶液为流动相 B， 采用梯度洗脱、 双波长检测， 程序见表 1; 体积流量 1.0 mL/min; 柱温为 25 ℃; 进样量 10 μL。

2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取阿魏酸、丹酚酸 B对照品适量， 置棕色量瓶中， 加 75%甲醇溶 解， 制成阿魏酸对 照 品 贮 备液 （0.121 8 mg/mL） 和 丹 酚 酸 B 对 照 品 贮 备 液（3.311 mg/mL）。 取上述贮备液各 1 mL至 10 mL棕色量 瓶中， 加 75%甲 醇 定 容， 混 匀， 制成每1 mL含阿 魏 酸 12.18 μg、 丹 酚 酸 B 331.1 μg的 对照品混合溶液。上述溶液均避光、冷藏保存。

表1 梯度洗脱色谱条件Tab.1 Condition of the gradient elution

2.1.3 供试品溶液的制备 取丹灯通脑胶囊 20粒 ， 精密 称 定， 计 算 ， 其 平 均 装 量 为 0.361 7 g。将内容 物 研 细、 混 匀 ， 精 密 称 定 2.277 2 g置 具 塞锥形瓶中， 精密加入75%甲醇50mL， 密塞，称定质量， 超 声 处 理 1 h （ 功 率 300 W， 频 率 37 kHz，室温）， 放冷， 再称定质量， 用 75%甲醇补足减失的 质量， 摇匀 ， 离 心 15 min （3 500 r/min） ， 静置，取上清液， 用 0.45 μm的微孔滤膜过滤， 取滤液，即得。上述溶液均避光、冷处保存。

2.1.4 阴性对照溶液的制备 按该药品的处方比例和制法，制备不含丹参和川芎的样品，依照“2.1.3” 项下的方法制备阴性对照溶液。

2.1.5 专属性试验 分别精密吸取上述对照品溶液、 供试品溶液和阴性对照溶液 10 μL， 按上述色谱条件进样测定，结果表明阴性样品在与供试品中阿魏酸、丹酚酸B相同的保留时间处无干扰峰。具体见图1。

图1 阿魏酸与丹酚酸B的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s of ferulic acid and salvianolic acid B

2.1.6 线性关系考察 分别精密吸取阿魏酸、丹酚酸 B对 照 品 贮 备 溶 液 0.5、 1.0、 2.0、 5.0、10.0 m L分别置20 m L棕色量瓶中， 加75%甲醇定容， 摇匀。 按上述色谱条件， 分别进样10 μL进行测定。以进样质量浓度为横坐标，以峰面积值为纵坐标进行线性回归，得阿魏酸的回归方程及相关系数为 Y=55 476 783X+41 715， r=0.999 6 （n= 5）; 丹酚酸 B为 Y=12 220 321X+86 821， r= 0.999 7 （ n=5）。 结 果 表 明阿 魏 酸 在 3.045 ～60.90 μg/mL、 丹酚酸 B在 82.78 ～1 655.5 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.7 精密度试验 取 “2.1.2” 项下对照品混合溶液连续测定 5 次， 每次进样 10 μL， 按峰面积计算: 阿魏酸与丹酚酸 B的相对标准偏差 （RSD）分别为1.3%和 1.5%。 结果表明精密度良好。

2.1.8 稳定性试验 取同一批号 （C1713016） 的供试品溶液， 分别于0、 1、 2、 4、 8、 12、 24 h 进样10 μL进行测定， 数据显示阿魏酸与丹酚酸 B的峰面积均无明显变化，按峰面积计算阿魏酸与丹酚酸 B的相对标准偏差 （RSD） 分别为 1.2% 和1.7%。结果表明样品在 24 h 内稳定。

2.1.9 重复性试验 称取同一批号 （C1713016）样品 6 份， 按 “2.1.3” 项下方法平行制备供试溶液进行测定，结果阿魏酸与丹酚酸B的平均含有量的 RSD（n=6）分别为 1.8%和 0.8%。 结果表明本方法重复性良好。

2.1.10 加样回收率试验 精密称定已测定含有量的丹灯通脑胶囊 （ 批号 C1713016） 的样品粉末 9份，分成3组，每组分别精密加入相当于样品中所含阿魏酸与丹酚酸 B量的 80%、 100%、120%的对照品贮备液，按上述色谱条件测定，计算加样回收率， 结果见表2。

表 2 阿魏酸、 丹酚酸 B加样回收率试验结果 （n=9）Tab.2 Results of recovery tests for ferulic acid and salvianolic acid B （ n=9）

2.1.11 样品测定 精密称定同一生产厂家 3 个不同批号的丹灯通脑胶囊样品粉末各 3份，按“2.1.3” 项下方法制备供试溶液， 进样 10 μL进行测定，用外标法计算阿魏酸与丹酚酸B量，结果见表3。

表 3 样品测定结果 （n=3）Tab.3 Results of determ ination（n=3）

2.2 HPLC法同时测定葛根素与野黄芩苷

2.2.1 色谱条件 以 Thermo Hypersil GOLD （ C18）柱为色谱柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）; 以乙腈-0.1%磷酸水溶液 （16 ∶84） 为流动相， 双波长检测（0 ～10 min， 250 nm;10 ～35 min， 336 nm）; 体积流量 1.0 mL/min; 柱温为 35 ℃; 进样量 10 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取葛根素、野黄芩苷对照品适量，加甲醇溶解，制成葛根素对照品贮备液 （1.145 6 mg/m L） 和野黄芩苷对照品贮备液 （1.269 0 mg/mL）。 取上述对照品贮备液各1 mL置10 m L量瓶中， 加甲醇定容， 混匀， 制成每 1 mL含葛根素 114.56 μg、 野黄芩苷 126.90 μg的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取丹灯通脑胶囊 20粒， 精密称定， 计算其平均装量为 0.358 8 g。 将内容 物 研 细、 混 匀， 精 密 称 定 2.445 1 g， 置100 mL量瓶中， 加 70%甲醇定容， 超声处理 30 min （功率 300 W， 频 率 37 kHz， 室 温）， 冷 却、静置， 加 70%甲醇补足至刻度， 摇匀， 离心 20 min （3 500 r/min） 。 精密量取上清液 5 mL， 置 10 mL量瓶中， 加 70%甲醇至刻度， 摇匀， 用 0.45 μm的微孔滤膜过滤，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 按该药品的处方比例和制法，制备不含葛根和灯盏细辛的样品，依照“2.2.3” 项下的方法制备阴性对照溶液。

2.2.5 专属性试验 分别精密吸取上述对照品溶液、 供试品溶液和阴性对照溶液 10 μL， 按上述色谱条件进样测定，结果表明阴性样品在与供试品中葛根素、野黄芩苷相同的保留时间处无干扰峰。具体见图2。

2.2.6 线性关系考察 分别精密吸取葛根素、 野黄芩 苷 对 照 品 贮 备 溶 液 0.5、 1.0、 2.0、 5.0、10.0 mL分别置 20 mL量瓶中， 加甲醇定容， 摇匀。 按上述色谱条件， 分别进样 10 μL进行测定。以进样质量浓度为横坐标，以峰面积值为纵坐标进行线性回归，得葛根素的回归方程及相关系数为Y=38 952 549X+175 499， r=0.999 8 （n=5）;野黄芩苷为 Y=26 993 729X+112 340， r=0.999 7（n=5 ）。 结 果 表 明 葛 根 素 在 28.64 ～572.80 μg/mL、 野黄芩苷在 31.725 ～634.50 μg/mL范围内线性关系良好。

图2 葛根素与野黄芩苷的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of puerarin and scutellarin

2.2.7 精密度试验 取 “2.2.2” 项下对照品混合溶液连续测定 5 次， 每次进样 10 μL， 按峰面积计算: 葛根素与野黄芩苷的相对标准偏差 （RSD）分别为0.7%、0.9%。 结果表明精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取同一批号 （C1713020） 的供试品溶液， 分别于0、 1、 2、 4、 8、 12、 24 h 进样 10 μL进行测定， 数据显示葛根素与野黄芩苷的峰面积均无明显变化，按峰面积计算，葛根素与野黄芩苷的相对标准偏差 （RSD） 分别为 0.8%和1.2%。 结果表明样品在 24 h 内稳定。

2.2.9 重复性试验 称取同一批号 （C1713020）样品 6 份，按 “2.2.3”项下方法平行制备供试溶液进行测定，结果葛根素与野黄芩苷的平均含有量的 RSD（n=6） 分别为 0.6%和 0.7%。 结果表明本方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 精密称定已知含有量的丹灯通脑胶囊 （批号 C1713020） 的样品粉末 9 份，分成3组，每组分别精密加入相当于样品中所含葛根素与野黄芩苷量的 80%、 100%、 120%的对照品贮备液，按上述色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表4。

2.2.11 样品测定 精密称定同一厂家 3 个不同批号的丹灯通脑胶囊样品粉末各 3 份，按 “2.2.3”项下方法制备供试溶液， 进样 10 μL进行测定， 用外标法计算葛根素与野黄芩苷的量， 结果见表5。

3 讨论

3.1 丹灯通脑胶囊现行的两个质量标准［1-2］均只对其单一组分进行质量控制，且方法各异，不能全面地反映该药品的质量。本实验采用高效液相色谱法，应用梯度洗脱、双波长检测的方法，同时对该药品有效成分阿魏酸与丹酚酸B、葛根素与野黄芩苷进行定量分析，实验结果表明所用方法操作简便、专属性好、检测效率高，可用于该制剂的质量控制。

表 4 葛根素、 野黄芩苷加样回收率试验结果 （n=9）Tab.4 Results of recovery tests for puerarin and scutellarin（n=9）

表 5 样品测定结果 （n=3）Tab.5 Results of determ ination（n=3）

3.2 参考相关文献［3-17］， 采用加热回 流、 超 声 提取2种方法对样品提取结果进行了考察比较，结果显示超声提取的方法操作简便、提取效率较好。“2.1” 项选用乙醇、 75%乙醇、 甲醇、 75%甲醇 4种提取溶剂进行考察， “2.2” 项选用乙醇、 70%乙醇、 甲醇、70%甲醇 4 种提取溶剂进行考察， 结果显示 “2.1”、 “2.2” 项分别用 75%甲醇和 70%甲醇提取的样品杂质较少、目标成分转移率高，适于相应实验样品的提取。

3.3 通过紫外分光光度计的扫描， 本实验 4 个有效成分丹酚酸B、野黄芩苷、阿魏酸、葛根素分别在 286 nm、 335 nm、 321 nm、 250 nm处有最大吸收， 与 《 中国药典》［3］中丹参、 灯盏细辛、 川芎、葛根四味中药有效成分标注的检测波长一致，由此确定了上述有效成分的吸收波长。

3.4 “2.1” 项比较了甲醇-1%冰醋酸水溶液、 甲醇-0.2%磷酸水溶液 2 种流动相系统， 结果显示采用甲醇-0.2%磷酸水溶液作为流动相， 待测组分有响应值，且出峰时间理想，分离效果和峰形均较好，适于该药品上述组分的检测分析。

3.5 “2.2” 项采用同一流动相， 在 250 nm与336 nm波长处各测试了 1 次样品， 结果显示葛根素、野黄芩苷在各自最大吸收波长以外的响应值均偏低，不利于检测分析;后借鉴 《中国药典》 中多巴丝肼片［18］含量测定项下的双波长检测方法，采用在同一流动相下切换波长的检测方法 （葛根素检测波长为 250 nm， 待葛根素出峰完全后检测波长改为336 nm， 以待检测野黄芩苷）， 结果显示该方法操作简便、分离效果好，适于该药品上述组分的检测分析。

［1］ 国家药品监督管理局.国家中成药标准汇编: 经络肢体、脑系分册［S］.2002:254-257.

［ 2 ］ 国家食品药品监督管理局.国家药品标准 （试行） WS-10751 （ ZD-0751） -2002-2011Z［ S］.2011.

［ 3 ］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010 年版一部［S］.北 京: 中 国 医 药 科 技 出 版 社， 2010:38， 70-71，138， 312-313.

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Sim ultanous determ ination of ferulic acid， salvianolic acid B， puerarin and scutellarin in Dandeng Tongnao Capsules by HPLC

WANG Ding-feng， HU Bing， WANG Li-qing

（ Fujian Putian Institute for Drug Control， Putian 351100， China）

AIM To develop an HPLCmethod for simultaneously determining the contents of ferulic acid and salvianolic acid B， puerarin and scutellarin in Dandeng Tongnao Capsules（ SalviaeMiltiorrhizae Radix et Rhizoma，Erigerontic Herba， Chuanxiong Rhizoma， Puerariae Lobatae Radix） .METHODS The analyticalmethod was established using SHIMADZU LC-2010AHTHPLC system.The HPLC column used in this studywas Thermo Hypersil GOLD （ C18） column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） in a gradient elution mode with dual wavelength detection（0-10 min， 250 nm;10-35 min， 336 nm） .RESULTS The linearity ranges obtained from the calibration curves of ferulic acid， salvianolic acid B， puerarin and scutellarin were 3.045-60.90 μg/mL（ r=0.999 6 ） ，82.78-1 655.5 μg/mL（r=0.999 7），28.64-572.80 μg/mL（r=0.999 8）， 31.725-634.50 μg/mL（r= 0.999 7） ， respectively.The average recoveries and RSD （ n=9 ） were 100.2% （ RSD of 0.5%） ， 100.0%（ RSD of0.7%）， 99.8% （ RSD of0.8%）， and 100.0% （RSD of0.7%）， respestively.CONCLUSION This method is an improvementof two current standards， which only concentrateson themeasurement of one constituent.

Dandeng Tongnao Capsules;ferulic acid;salvianolic acid B;puerarin;scutellarin;HPLC

R927.2

:A

1001-1528（2014）12-2532-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.019

2014-02-18

王鼎峰 （1977—）， 男， 副主任药师， 从事药品检验和质量研究。 Tel:18059552158， （0594 ） 2601069， E-mail:wd f0594@ 163.com