单 萌, 马桂芝, 罗 茜, 李 岩, 于富生, 滕 亮, 程雪梅, 王长虹*

（1.新疆医科大学药学院, 新疆 乌鲁木齐 830011； 2.新疆华圣元医药科技有限公司, 新疆 乌鲁木齐830011； 3.新疆医科大学第一附属医院药学部, 新疆 乌鲁木齐 830011； 4.上海中医药大学中药研究所；中药标准化教育部重点实验室；中药新资源与质量标准综合评价国家中医药管理局重点研究室；上海市复方中药重点实验室, 上海,201210）

骆驼蓬籽中脂肪酸定量分析的甲酯化条件优选

单 萌1, 马桂芝1, 罗 茜1, 李 岩1, 于富生2, 滕 亮3,4*, 程雪梅4, 王长虹4*

（1.新疆医科大学药学院, 新疆 乌鲁木齐 830011； 2.新疆华圣元医药科技有限公司, 新疆 乌鲁木齐830011； 3.新疆医科大学第一附属医院药学部, 新疆 乌鲁木齐 830011； 4.上海中医药大学中药研究所；中药标准化教育部重点实验室；中药新资源与质量标准综合评价国家中医药管理局重点研究室；上海市复方中药重点实验室, 上海,201210）

目的 优选骆驼蓬籽中脂肪酸定量分析的甲酯化条件。 方法 以5种脂肪酸 （油酸、 亚油酸、 亚麻酸、 棕榈酸、花生酸）的总量、甲酯化峰个数及百分峰面积的综合评分为优选指标，采用正交试验分别对4种甲酯化过程进行条件优选， 并通过横向比较确定合适的脂肪酸甲酯化条件。 结果 1%H2SO4-甲醇回流法更适合用于骆驼蓬籽中脂肪酸的甲脂化， 优选条件为醇油体积比 4 ∶1， 催化剂与油的体积比 2 ∶1， 反应温度为 80 ℃， 回流时间为 30 min。 结论验证试验表明优选出的甲酯化工艺稳定性好、反应时间短，可作为气相色谱法的前处理方法，用于骆驼蓬籽中脂肪酸含量测定。

骆驼蓬籽;脂肪酸;甲酯化;正交试验

骆 驼 蓬 （ Peganum harmala L.） 系 蒺 藜 科（Zygophyllaceae）植物， 是维吾尔、 蒙古族民间习用药材，已被列入维 吾 尔 药卫生部药 品 标 准［1］，种子和全草均做药用，主治咳嗽气喘、无名肿痛等症［2］。 骆驼蓬籽脂肪油中脂肪族化合物占绝对优势， 其中脂肪酸量较高［3］。骆驼蓬脂肪酸不但有重要的 经济价值， 而 且 具 有镇痛消炎 的 作 用［3］，具有进一步开发应用的前景。对于大多数植物油中脂肪酸而言，气相色谱法是其最常用的色谱分析方法［4-5］。 但脂肪 酸 本 身 极 性 大、沸点高， 在300 ℃以内不易气化，气相色谱分析首先需要对脂肪酸进行甲酯化处理， 有利 于气相 色谱法分离［6-7］。 常用的甲酯化方法分为酸催化、 碱催化两大类［6］， 各有其优缺点， 且使用范围各不相同［8］。 而文献和参考资料中使用的酸碱浓度、反应时间等也有差异。因此，测定骆驼蓬籽油中的脂肪酸，选择甲酯化完全、快捷的甲脂化方法至关重要。

本实验以5种脂肪酸 （油酸、亚油酸、 亚麻酸、棕榈酸、花生酸）的总含有量、甲酯化峰个数及百分峰面积为指标计算综合评分，采用正交实验设计分别对 4 种甲酯化方法 （ KOH-甲醇法、BF3-甲醇法、 NaOH-甲醇法及 1%H2SO4-甲醇回流法）进行了甲酯化条件的优选，确定了适合骆驼蓬籽中脂肪酸含量测定的甲酯化条件，为骆驼蓬籽中脂肪酸的定量分析奠定基础。

1 试剂材料与仪器

1.1 试剂材料 骆驼蓬籽 （采自新疆乌鲁木齐西山; 批号 120820， 上海中医药大学中药研究所王长虹研究员鉴定）; 亚油酸甲脂对照品 （购自 AccuStandard， Inc.，纯度 99.4%以上， 批号 23139）;亚麻酸甲脂对照品 （ 购自 AccuStandard，Inc.， 纯度 99.0%以上， 批号 23038）; 油酸甲脂对照品（ 购 自 AccuStandard， Inc.， 纯 度 100%， 批 号22810）; 花生酸甲酯对照品 （ 购自 AccuStandard，Inc.， 纯度 99.5%以上，批号 22747） 棕榈酸甲脂对照品 （购自 AccuStandard， Inc.， 纯度 99.0%以上， 批号 5920）; 石油醚 （60 ～90 ℃， 天津富宇精细化工有限公司， 批号 20111005）; 甲醇 （天津富宇精细化工有限公司， 批号 20120314）; 正庚烷（天津富宇精细化工有限公司，批号 20110508）; NaOH （天津市盛奥化学试 剂有限 公司， 批号20111203）;14% 三 氟 化 硼 甲 醇 溶 液 （Shanghai ANPEL Scientific Instrument Co， Ltd. 批 号4.110056.0500）;NaCl（天津市福晨化学试剂厂，批号 20121220）;H2SO4（成都市科龙化工试剂厂，批号:20120926）; 无水 Na2SO4（天津市天达净化材料精细化工厂， 批号 121025）， 以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器 气相色谱仪 （GC-2010， 日本岛津）;氮氢空一体机 （NHA-500， 北京中惠普分析技术研究所）; 电子天平 （BS110S， 北京赛多利斯天平有限公司， d=0.01 mg）; 恒温水浴锅 （ HWS-24，上海一恒科技有限公司）;索氏提取器。

2 方法和结果

2.1 优化指标 以 5 种脂肪酸 （油酸、 亚油酸、亚麻酸、棕榈酸、花生酸）的总含有量、甲酯化的峰个数、百分峰面积的综合评分为优化指标。其中，峰个数主要是根据分离度来确定，分离度大于1.5 的峰计作一个有效峰; 每个峰的百分面积为扣除溶剂峰后的百分面积。按下式计算综合评分。

中五种脂肪酸量之和的最大值”、 “试验中甲酯化峰个数的最大值”、 “试验中百分峰面积最大值”均为四种甲酯化方法各自所能达到的最大值。

2.2 外标一点法测定五种脂肪酸的量

2.2.1 气相色谱分析条件 检测条件:PEG-20M（30 m×0.25 mm×0.25 μm） 弹性石英毛细管柱;载气为高纯氦气 （99.99%）; 体积流量 1 mL/min，进样口温度 250 ℃; 程序升温: 色谱柱初始温度140.0 ℃ （保持 2.00 min） ， 以 7.5 ℃ /min 升温速率升至 170 ℃ （保持 1.0 min）， 以 2 ℃ /min 升温速率升至 215 ℃，保持 12.0 min; 以 2 ℃ /min 升温至 240 ℃ （保持 5.00 min）， 分流比为 50 ∶1，进样量为1.00 μL。 在上述色谱条件下， 5 种脂肪酸甲酯化物和供试品中其它组分色谱峰可达基线分离且分离度良好。

2.2.2 混合对照品贮备液的配制 分别精密称取亚油酸甲脂 6.426 mg、 亚麻酸甲酯 1.015 mg、 油酸甲酯 2.080 mg、 花生酸甲酯 1.135 mg、 棕榈酸甲酯 1.208 mg置于 10 mL量瓶中， 加正庚烷溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含上述对照品依次为0.642 6、 0.101 5、 0.208 0、 0.113 5、 0.120 8 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3 脂肪油提取及测定 称取干燥至恒定质量的骆驼蓬籽 （20 目）20 g， 置于索氏提取器中，加入120 mL石油醚， 80 ℃水浴回流 6 h， 提取液备用。

脂肪酸提取物按不同甲酯化条件甲酯化后，按“2.2.1” 项进样、 测定， 按外标一点法计算 5 种脂肪酸的总含量。

2.3 正交试验优选 4 种甲酯化方法的甲酯化条件

文献调研与预试验均表明影响油脂与甲醇亲核酯交换催化反应体系的主要因素为催化剂与油的体积比、醇油比、反应温度、反应时间。本实验以综合评分法为优选指标， 采用 L9（34）重复正交法考察以上影响因素对指标的影响，并确定其甲酯化条件。2.3.1 BF3-甲醇回流法

2.3.1.1 甲酯化过程 吸取骆驼蓬籽脂肪油10.00 mL置 于 锥 形 瓶 中， 加 入 NaOH-甲 醇 溶 液（0.5 mol/L） 及沸石，水浴回流， 用移液管从上端加入 14%三氟化硼甲醇溶液于沸腾的溶液中， 继续 煮 沸 2 min， 从 冷 凝 管 顶 端 加 入 正 庚 烷 约8.0 mL，继续煮沸 1 min， 停止加热， 冷却至室温后取下冷凝管［9］。 加入少量 NaCl饱和水溶液并轻摇锥形瓶数次， 继续加入 NaCl饱和水溶液， 吸取上层液， 加入 3 g无水 Na2SO4， 过滤， 按 “2.2.1”项色谱条件测定5种脂肪酸的总含量，同时对其色谱图进行分析，计算其综合评分。

2.3.1.2 正交试验设计及其结果 采用 L9（34）重复正交法优选甲酯化条件。试验因素水平表见表1， 试验安排及正交结果见表 2， 直观分析见表 2，方差分析结果见表3。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表 2 L9（34） 正交试验设计方案及结果 （n=27）Tab.2 L9（34） orthogonal design and its results（ n=27）

表3 综合评分方差分析Tab.3 Variance analysis of com prehensive scores

直观分析和方差分析均表明各因素对脂肪酸甲脂化的影响因素顺序为A＞B＞C＞D， 即醇油比 ＞催化剂与油的体积比＞反应温度＞回流时间; 最佳工艺为 A1B3C3D3，即醇油比 2 ∶1， 催化剂 ∶油为1.5 ∶1.0， 反应温度为 80 ℃， 回流时间为 60 min。方差分析结果表明4个因素对脂肪油的甲酯化效果均有显著性影响 （P＜0.01）。

2.3.1.3 验证试验 取三批骆驼蓬籽脂肪油， 按优选条件进行甲酯化并测定其脂肪酸量，5种脂肪酸总质量分数 （41.09 ±1.19） mg/g， 峰个数为（38.67 ±0.58） 个， 百 分 峰 面 积 为 （5.47% ± 0.07%）， 计算其综合评分，所得结果为 100.03 ± 2.28。 验证试验表明优选工艺稳定、 可行。

2.3.2 KOH-甲醇回流法

2.3.2.1 甲 酯 化 过 程 取 骆 驼 蓬 籽 脂 肪 油10.00 mL， 置于 100 mL锥形瓶中，加入甲醇，充分混匀， 再加入 KOH（1 mol/L） 甲醇催化剂及沸石， 回流， 移至分液漏斗［10］。 用10 m L正庚烷冲洗烧瓶并将其并入分液漏斗中，加入 10 mL蒸馏水，摇匀使分层，甲酯化进入上层液 （正庚烷层），分离出正庚烷层， 并用无水 Na2SO4干燥， 滤过， 按“2.2.1” 项色谱条件进样并测定 5 种脂肪酸的量，同时对其色谱图进行分析，计算其综合评分。

2.3.2.2 正交试验设计及其结果 采用 L9（34）重复正交法优选甲酯化条件。试验因素水平表见表4， 试验安排及正交结果见表 5， 直观分析见表 5，方差分析结果见表6。

表4 因素水平Tab.4 Factors and levels

表 5 L9（34） 正交试验设计方案及结果 （n=27）Tab.5 L9（34） orthogonal design and its results（ n=27）

表6 综合评分方差分析Tab.6 Variance analysis of com prehensive scores

直观分析和方差分析表明各因素对脂肪酸甲酯化的影响因素顺序为C＞B＞A＞D，即反应温度 ＞催化剂与油的体积比＞醇油比＞回流时间; 最佳工艺为 A2B1C1D1，即醇油比 2 ∶1， 催化剂 ∶油为1 ∶1， 反应温度为 40 ℃， 回流时间为 30 min。 方差分析结果表明醇油比对脂肪油的甲酯化效果均有显著性影响 （P＜0.05）。

2.3.2.3 验证试验 取 3 批骆驼蓬籽脂肪油， 按优选条件进行甲酯化并测定其脂肪酸量，5种脂肪酸总质量分数 （21.89 ±0.41） mg/g， 峰个数为（46.67 ±0.58 ） 个， 百 分 峰 面 积 为 4.46% ±0.04%， 计算其综合评分， 所得结果为 102.09 ± 1.39。 验证试验表明优选工艺稳定、 可行。

2.3.3 NaOH-甲醇回流法

2.3.3.1 甲酯化过程 取 10.00 m L骆驼蓬籽脂肪油置于 100 m L锥形瓶中， 加入甲醇， 充分混匀，再加入 NaOH （0.5 mol/L） 甲醇溶液及沸石， 回流， 移至分液漏斗［3］。 用 10 mL正庚烷冲洗烧瓶并将其并入分液漏斗中， 加入20 mL蒸馏水， 摇匀使分层， 甲酯化物进入上层液 （正庚烷层）， 分离出正庚烷层， 并用无水 Na2SO4干燥，滤过， 按“2.2.1” 项色谱条件进样并测定 5 种脂肪酸的量，同时对其色谱图进行分析，计算其综合评分。

2.3.3.2 正交试验设计及其结果 采用 L9（34）重复正交法优选甲酯化条件。试验因素水平表见表7， 试验安排及正交结果见表 8， 直观分析见表 8，方差分析结果见表9。

表 7 L9（34） 因素水平Tab.7 Factors and levels

表 8 L9（34） 正交试验设计方案及结果 （n=27）Tab.8 L9（34） orthogonal test and its results（ n=27）

表9 综合评分方差分析Tab.9 Variance analysis of comprehensive scores

直观分析和方差分析表明各因素对脂肪酸甲酯化的影响因素顺序为A＞C＞B＞D， 即醇油比 ＞反应温度 ＞催化剂与油的体积比 ＞回流时间; 最佳工艺 为 A2B1C2D2， 即 醇 油 比 4 ∶1， 催 化 剂 ∶油 为1 ∶1， 反应温度为 60 ℃， 回流 时 间为 40 min。 方差分析结果表明4个因素对脂肪油的甲酯化效果均有显著性影响 （P＜0.01）。

2.3.3.3 验证试验 平行移取 3 份骆驼蓬籽脂肪油，按优选条件进行甲酯化并测定其脂肪酸量，5种脂肪酸总质量分数 （28.95 ±0.56） mg/g， 峰个数为 （54.67 ±0.58） 个， 百分峰面积为 5.62% ± 0.05%， 计算其综合评分， 所得结果为 98.67 ± 1.48。 验证试验表明优选工艺稳定、 可行。

2.3.4 1%H2SO4-甲醇回流法

2.3.4.1 甲酯化过程 取 10.00 mL骆驼蓬籽脂肪油置于100 mL锥形瓶中， 加入一定量的甲醇，充分混匀， 再加 1%H2SO4-甲醇于水浴锅回流一定时间［11］， 冷却， 加入 10 mL正庚烷， 振摇， 加蒸馏水 20 mL， 再加入无水 Na2SO4干燥， 取上清液，滤过， 按 “2.2.1” 项色谱条件进样并测定 5 种脂肪酸的量，同时对其色谱图进行分析，计算其综合评分。

2.3.4.2 正交试验设计及其结果 本实验采用L9（34）重复正交法优选甲酯化条件。 试验因素水平表见表10， 试验安排及正交结果见表 11， 直观分析见表11， 方差分析结果见表 12。

表 10 因素水平Tab.10 Factors and levels

表 11 L9（34）正交试验设计方案及结果（n=27）Tab.11 L9（34） orthogonal test and its results（ n=27）

表 12 综合评分方差分析Tab.12 Variance analysis of com prehensive scores

直观分析结果表明各因素对脂肪酸甲酯化的影响因素顺序为 C＞B＞A＞D， 即反应温度 ＞催化剂与油的体积比 ＞醇油比 ＞回流时间;最佳工艺为A2B2C3D1， 即醇油比 4 ∶1， 催化剂 ∶油为 2 ∶1，反应温度为 80 ℃， 回流时间为 30 min。 方差分析结果表明3个因素对脂肪油的甲酯化效果均有显著性影响 （P＜0.05）。

2.3.4.3 验证试验 取 3 批骆驼蓬籽脂肪油， 按优选条件进行甲酯化并测定其脂肪酸总含量，5种脂肪酸总质量分数 （42.70 ±0.84） mg/g， 峰个数为 （47.67 ±0.58） 个， 百分峰面积为 （8.93% ± 0.01%）， 计算其综合评分， 所得结果为 98.60 ± 1.38。 验证试验表明优选工艺稳定、 可行。

2.3.5 不同甲酯化方法的验证试验结果比较分析

采用统计学软件 SPSS 13.0 将 4 种甲酯化条件下测定的验证试验的数据进行分析， 见表 13。1%H2SO4-甲醇回流法与其他 3 种方法比较采用Tukey法， P ＜0.05 认为差异有显著性，有统计学意义。

表 13 验证试验Tab.13 Validation test

通过对以上4种甲酯化方法优选条件的验证试验结果进行比较， 可见 1%H2SO4-甲醇回流法更适合用于驼蓬籽中脂肪酸的甲酯化，其优选条件为:醇油比 4 ∶1， 催化剂 ∶油为 2 ∶1， 反应温度为80 ℃， 回流时间为 30 min。

3 小结与讨论

3.1 综合评分体系的建立 本实验旨在建立一种可用于测定骆驼蓬籽中脂肪酸总含量的气相色谱方法，需要对其关键的前处理步骤——甲酯化进行条件优选。该气相色谱方法不仅需要准确对5种脂肪酸的总含量进行定量测定，同时需要尽可能的获得更多的色谱峰信息，以期可以兼顾定量与定性、局部与全部信息。因此，在建立综合评分体系时不仅考虑了5种已知脂肪酸的总含量，同时考察了甲酯化峰的个数和百分峰面积。由于5种脂肪酸是骆驼蓬脂肪油的主要成分，定量测定结果客观、准确，所以给5种已知脂肪酸的含量赋予 60 分的权重，甲酯化峰的个数和百分峰面积分别给与 20分的权重。

3.2 甲酯化方法及其条件的确定 横向比较结果表明 1%H2SO4-甲醇回流法更适合用于骆驼蓬籽中脂肪酸的甲脂化，5种定量的脂肪酸量最高，说明甲酯化程度高于其它3种方法;且所占整个图谱的百分峰面积也是最大的，将其气相图谱进行比较，峰个数也多于其它3种方法;并且该法反应时间短，方法快捷、 简便。 因此， 确定 1%H2SO4-甲醇回流法作为骆驼蓬脂肪酸的甲酯化方法。

3.3 甲酯化率差异的原因分析 通过对酸、 碱催化的两类常用的甲酯化方法进行研究对比发现，碱法 KOH-甲醇回流法和 NaOH-甲醇回流法甲酯化程度相似， 且其甲酯化效率高于 BF3-甲醇回流法。而酸法 H2SO4-甲醇溶液法与碱法存 在 较大差异，甲酯化程度明显高于碱法 KOH-甲醇回流法和NaOH-甲醇回流法。 这可能是因为碱法甲酯化只适合于脂肪油中的结合脂肪酸， 而 1%H2SO4-甲醇酯化既适合于游离脂肪酸，又适合于结合脂肪酸，甲酯化适应面广。

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Selection ofmethyl esterification for quantitative analysis of fatty acids from the Seeds of Peganum harmala

SHAN Meng1， MA Gui-zhi1， LUO Xi1， LI Yan1， YU Fu-sheng2， TENG Liang3，4*， CHENG Xue-mei4， WANG Chang-hong4*
（1.College of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China;2.Xinjiang Huashengyuan Medical Technology Co.， Ltd.， Urumqi 830011， China;3.Pharmacy Depatment， TheFisrt Hospital Affiliated to Xinjiang MedicalUniversity， Urumqi830011， China;4.TheMOEKey Laboratory for Standardization of ChineseMedicinesand The SATCM Key Laboratory for New Resourcesand Quality Evaluation of Chinese Medicines， Instituteof Chinese Materia Medica， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai Key Laboratory of Complex Prescription， Shanghai201210， China）

AIM To select the conditions ofmethyl esterification for the quantitative analysis of fatty acids from the seeds of Peganum harmala.METHODS A comprehensive scoring was taken， based on the total content of five fatty acids（ oleic acid， linoleic acid， linolenic acid， palmitic acid， and arachic acid） ， the peak num-bers and area percentage of peaks， with the orthogonal design employed to compare and figure out the optimal conditions of four differentmethyl esterifications for fatty acids.RESULTS 1%sulfuric acid-methanol refluxmethod was determined as a satisfyingmethyl esterification， which consisted of 4 ∶1 volume ratio ofmethanol to oil，2 ∶1 volume ratio of catalyst to oil， 80 ℃ reaction temperature， and 30 min reaction time.CONCLUSION The validation tests indicate that the optimum process is stable and speedy， and it lays a foundation for gas chromatography of fatty acids in P.harmala.

seeds of Peganum harmala;fatty acids;methyl esterification;orthogonal test

R284.1

:A

1001-1528（2014）12-2497-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.012

2014-05-29

国家自然基金 /新疆联合基金重点项目 （ U1130303）; 上海市博士后基金 （13R21415800）; 乌鲁木齐市科技攻关计划（G121320004）

单 萌 （1989—）， 女， 硕士生， 研究方向: 中药民族药新药研究。 Tel:15276726275， E-mail:shanmeng0206@163.com

*通信作 者: 滕 亮 （ 1975—） ， 博 士， 教 授， 硕 士 生 导 师， 研 究 方 向: 中 药 民 族 药 新 药 研 究。 Tel: （ 0991 ） 4362483， E-mail: tl750212@126.com王长虹 （1964—）， 博士， 研究员， 博士生导师， 研究方向: 中药新制剂与体内过程研究。 Tel: （021） 51322511， E-mail:wchcxm@hotmail.com