林泽文，周小丽*，俞立英，吴兴文，徐 蒙，刘木清

(1.复旦大学光源与照明工程系，上海 200433；2.复旦大学附属华山医院口腔科，上海 200040)

1 引言

光动力疗法(Photodynamic Therapy, PDT)是指通过特定波长光的照射，使组织吸收的光敏剂(photosensitizer, PS)发生光化学反应，在有氧环境下，激发态的光敏剂将能量传递给周围的氧分子，生成活性氧(reactive oxygen species, ROS)与相邻的生物大分子发生氧化反应，产生很强的细胞毒性作用，进而导致细胞受损乃至死亡[1]。近年来，PDT作为一种辅助治疗方法被广泛地应用于口腔疾病的治疗中，包括牙体硬组织疾病、牙髓疾病、牙周炎症[2], [3]等。

在PDT中通常采用激光光源，然而目前开发的所有激光器，由于制作原理和实用价值的原因，限制了其在生物医学方面的应用[4]。LED具有高效节能、寿命长、易维护、结构简单、电源小巧、价格低廉等特点，使其在家庭便携PDT的推广上，有着传统激光器所无法比拟的优势。LED和激光器的最大的区别在于光的单色性和相干性。由于PDT治疗中所用的光敏剂具有一个较宽的吸收带，通常为10～20nm，甚至更宽，而目前生产的LED的半波带宽可以达到±10nm，所以单色性对于治疗效果无显著影响[5]。有相关研究表明光的相干性对光治疗产生影响并没有理论和实际依据[6]。 本文通过实验研究LED光源对牙周炎进行光动力治疗的可行性，还进一步探究了不同光照参数组合下的最优杀菌治疗方案，为家庭便携式PDT治疗仪器的设计提供了理论基础。

2 实验装置

新型光敏剂的强烈吸收带一般在650～850nm之间[1]，本文中选用660nm波长红光LED作为照射光源，采用亚甲基蓝(methylene blue, MB)作为光敏剂对普雷沃牙周细菌进行体外杀菌实验。该光敏剂对峰值波长为660nm的红光有着强烈的吸收，并释放出大量单态氧，产生细胞毒素，杀死细菌。本文采用6颗大功率(1W)红光LED作为阵列对12孔细胞培养板进行照射，保证在照射面形成0～100mW/cm2的辐射照度。每颗LED配以光学透镜进行聚光，驱动采用可进行PWM调光的恒流驱动模式。图1为采用光谱分析仪测得的LED阵列的光谱。在全功率输出时，采用光量子流密度计测得被照射面上的平均辐照度为100 mW/cm2。

图1 实验用LED的光谱功率分布图Fig.1 The spectrum of experimental LEDs

由图1可以看出LED的峰值波长为657nm，光谱半宽度为20nm，能量主要都集中在MB的强烈吸收带上。虽然在单色性上LED阵列无法与激光相提并论，但如前文所述，PDT中使用的光敏剂吸收带带宽通常为10～20nm，甚至更宽，因此，实验采用的LED阵列完全能够满足治疗的要求。

3 实验研究

3.1 前期准备

3.1.1 细菌液体培养

复苏从患者牙周脓肿中分离的耐药野生株，并将其密涂在厌氧基础培养基血平板(OXID、5%脱纤维羊血)上。将平板放置于35～37℃厌氧环境中(N280%，H210%，CO210%)孵育2天，得到成熟菌落。取一定量的成熟菌落于液体培养基中，在35～37℃厌氧环境中(N280%，H210%，CO210%)孵育36小时，得到第二代细菌。

3.1.2 细菌菌液浓度选择

取经过36小时孵育的菌液，用培养液进行稀释。取稀释后的样本在分光光度计OD600下比浊,测出相应的OD(OD, optical density)值，再比对之前已经做过的OD值与CFU值曲线，即可大致推断出菌液浓度的数量级。本文取OD值为0.65～0.75的菌液(此时菌液浓度大致为107CFU/mL)。

3.1.3 紫外杀菌

将LED阵列、驱动、12孔细胞培养板、移液枪等实验要用到的各项器材置于超净台上，进行8分钟的紫外杀菌。

3.2 光照实验

3.2.1 实验分组

12孔细胞培养板编号如图2所示，其中有颜色标记的6个孔位将用于实验。记有光照条件为L+，无光照为L-；有光敏剂条件为M+，无光敏剂为M-，则6个孔位的实验条件如表1所示。

图2 12孔细胞培养板编号图Fig.2 Maps of the 12-well cell culture plate

表1 细胞培养板各孔位的实验条件Table 1 The experimental conditions for each well

3.2.2 实验参数

取浮游菌液浓度为107CFU/mL，MB浓度为0.05μmol/mL。光照密度与光照时间的取值如表2所示。

表2 各组实验的光照密度与光照时间参数Table 2 Experimental parameters for each group

3.2.3 实验步骤

① 先在A1、A2、D2孔位加入5μLMB溶液，再加入500μL浮游菌液，孵育2分钟；

② 在B1、B2、D3中加入对照菌液各500μL；

③ 将LED阵列扣在细胞培养板上，关闭超净台工作灯，打开LED电源，按照3.2.2节设定的实验参数对菌液进行照射，如图3所示；

④ 照射结束后，关闭LED，取出培养板中浮游菌液用于后期处理。

图3 用LED阵列照射浮游菌液Fig.3 Using the LED array to irradiate the bacteria suspension

3.3 后期处理

3.3.1 菌液稀释

对A1、A2、B1、B2、D2、D3中的菌液以及细菌原液(共7个样本)分别进行若干次的10倍次稀释，以便进行平板菌落计数。为使计数值落在置信区间上，对每一个样本取6种不同浓度的菌液进行接种，同时考虑到预期的处理效果，每一个样本的稀释倍数如表3所示。

表3 各样本稀释倍数Table 3 Dilution rate of each samples

3.3.2 平板菌落计数

将稀释好的菌液接种在厌氧基础培养基血平板上，每个平板对应一个样本。平板划分为6个相同大小的区域，每个区域接种一种浓度的菌液。将完成接种的平板放置于35～37℃厌氧环境中孵育，2天后取出平板进行菌落计数。将统计出的菌落数，根据稀释的倍数和取样接种量换算出每个菌液样本的CFU值，从而得出样本的杀菌率，以判断PDT治疗是否有效。

4 实验数据及分析

4.1 实验数据

为准确测量处理后的各样本菌液浓度，对于每一个实验样本，本文选择了孵育后菌落数量落在置信区间的接种样本，并根据其稀释倍数，换算出原样本的菌液浓度。表4记录了每一组实验的原菌液浓度以及经过处理并孵育的实验样本菌液浓度。

表4 原菌液及经过处理后的各实验组的浮游菌液浓度Table 4 The concentration of the original and the experimental bacteria suspension

4.2 数据处理及分析

4.2.1 PDT治疗可行性分析

根据表4，以原菌液浓度为分母，实验样本菌液浓度为分子，可以计算出每个样本经过处理后的牙周致病菌存活率。图4(a)、(b)、(c)分别表示当光照密度为10、20、40mW/cm2时，在不同的照射时间下，各实验样本的致病菌存活率。从图中可以看出，虽然光照的参数有所不同，但是在每一个单独的实验组中，添加了光敏剂并接受光照的实验样本的细菌存活率都要低于其他的实验样本。

图4 各实验组在不同光照密度下的牙周致病菌存活率Fig.4 The survival rate of bacteria under various irradiation

考虑到孵育环境以及孵育时间对菌液浓度的影响后，改用双阴性对照样本(L-M-)的菌液浓度作为分母，以其他样本菌液浓度作为分子，求得的牙周致病菌存活率。图5(a)、(b)及(c)所示的是光照密度分别为10、20、40mW/cm2时，在不同的照射时间下，考虑了时间因素以后的各实验样本的牙周致病菌存活率。从图中可以更明显地看出，添加了光敏剂并进行光照的实验样本组的细菌存活率远低于其他样本组。而单独进行光照或添加光敏剂的实验样本，其细菌存活率随光照密度及光照时间的变化则显示出较大的离散性。由此可见，使用LED为光源的PDT对于牙周炎的治疗的确有效，使用光敏剂的同时对细菌进行光照能够产生比单独使用光敏剂或仅仅接受光照更好的杀菌效果。

图5 考虑了时间因素后各实验组在不同光照度下的牙周致病菌存活率Fig.5 The survival rate of bacteria under various irradiation when time was considered

4.2.2 PDT治疗的最佳光照参数

图6所示的是同时添加了光敏剂并进行光照的实验样本，在不同光照参数组合下的细菌存活率。从图中可以看出，当光照密度较低时(10～20mW/cm2)，致病菌的存活率主要取决与光照时间——随着光照时间的增加，细菌存活率显著降低；当光照时间超过16min后，细菌存活率趋于稳定，并保持在一个很低的水准(3%以下)。当光照密度较高时(40mW/cm2),细菌存活率随光照时间增加而下降的幅度大大增加，在照射4min后，致病菌的存活率就低至3%以下；同样的，在照射16min后，细菌存活率趋于稳定，并且保持在一个更低的水准(0.1%以下)。由于在实际治疗的过程中，对病人患处进行长时间的照射是十分不便的，且低光照密度照射治疗过后仍会保持有3%左右的细菌存活率。因此，本文认为，在实验的18组不同光照参数中，以40mW/cm2的光照密度对患处进行8min的照射是比较适宜的治疗方案。

图6 不同光照参数下的牙周致病菌存活率Fig.6 The survival rate of the bacteria with different irradiation parameters

5 结论

本文通过实验验证了LED用于牙周治疗的可行性，实验的数据表明，同时使用光敏剂并接受光照的实验组，较其他的对照组，浮游菌液中的牙周致病菌存活率大大降低，即该实验组的杀菌效果远好于其他组。同时，从实验数据中还可以看出，光照时间越长，PDT治疗的杀菌率也就越高；当光照密度较高时，杀菌率随光照时间增加而上升的幅度大大增加。在实验的18组不同光照参数中， 40mW/cm2的光照密度配合8min的照射时间是比较适宜的治疗方案。本文的研究仅针对以LED为光源的PDT治疗对体外牙周致病菌的存活率的影响，至于PDT在临床上的治疗效果是否与体外实验相一致则有待将来进一步的研究。

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