王 鹏， 王文艳， 田 璐， 赵改名， 李苗云， 孙灵霞， 柳艳霞

(1.河南农业大学食品科学技术学院， 河南 郑州 450002；2.河南省肉制品加工与质量安全控制重点实验室，河南 郑州 450002)

冷却猪肉以其营养丰富、鲜香、利于人体吸收等优势成已为生鲜猪肉一种新的消费形态[1].冷却肉在0～4 ℃的低温环境中货架期较长[2].但目前中国冷链系统并不完善，当在贮藏、运输等过程中出现控制不当或温度波动时，微生物会迅速增殖，加速鲜肉变质[3,4].气调包装(MAP)是延长冷却肉货架期的有效的方法，合理的气调包装不但可以延长货架期还可以提高冷却肉的感官品质[5].气调包装中常用的气体成分主要是CO2，O2和N2，氧气的体积分数超过60%才能保持肉的色泽，二氧化碳不低于25%才能有效地抑制细菌的繁殖[6].目前，生鲜肉中常用的气体比例多是高氧的CO2和O2的混合，而当气体比例中CO2为30%～50%，氧气为50%～70%时，冷藏3 d后逐渐产生异味[7]，对冷却肉的保鲜效果差异较大.

响应面分析法是通过有限次数试验来获取各个因素条件下的试验结果[8]，进而采用多元二次回归方程来拟合各因素与响应值之间的对应关系，通过对回归方程的分析来寻求最佳试验条件，解决多变量问题的一种统计方法[9～11].目前关于气体比例优化的研究较多，但是通过响应面来优化气调包装冷却肉气体比例的研究还较少.反映冷却猪肉在贮藏期间的品质指标很多，其中细菌总数能够反映肉中微生物的增殖和新鲜程度，亮度值(L*)、红度值(a*)直接反映肉色的变化，pH值和电导率可反映肉新鲜度的变化[12].因此，本试验以CO2和O2为单因素，用响应面法设计优化试验，测定细菌总数，L*，a*，pH值，电导率，以上5个指标分别作为响应值，优化气体比例，为工业化气调包装气体比例提供理论依据，为延长冷却猪肉货架期提供有效手段.

1 材料与方法

1.1材料

猪背最长肌，河南某肉品企业生产，随机采取屠宰后24 h经过预冷后分配到郑州某超市配送中心的大排肌肉，用保鲜膜包裹，放置于装有冰袋的保温箱中，1 h内转移至实验室.

1.2主要仪器与设备

气调保鲜包装机(DT-6S)，大江机械设备有限公司；生化培养箱(SPX-ISOSH)，上海新苗医疗器械制造有限公司；均质机(Easy Mix)，法国AES公司；无菌操作台(SW-CJ-2F)，苏州安泰空气技术有限公司；电热恒温培养箱(DNP-9272)，上海精密实验设备有限公司；色彩色差计(CR-400)，日本KONICAMINOLTA公司；电导率仪(DDSJ-308A)，上海雷磁仪器有限公司；离子计(SJ-216)，上海精科仪器有限公司；回旋式振荡器(HY-5)，金坛市杰瑞尔电器有限公司.

1.3方法

1.3.1 取样及试验设计 分别取200 g肉样装入气调包装盒中(希悦尔包装有限公司),TQBC-0755，用气调保鲜包装机包装(上充气2.0，下充气1.0)，置于7 ℃贮藏，每2 d取样分析.以CO2和O2的比例作为影响因素做单因素试验.分为以下5组，气体比例分别为：1)20%CO2+60%O2+20%N2; 2) 30%CO2+50%O2+20%N2; 3)40%CO2+40%O2+20%N2; 4)50%CO2+30%O2+20%N2; 5)60%CO2+20%O2+20%N2.

1.3.2 细菌总数的测定 在无菌操作台里完成所有消毒过程后，称取25 g肉样，放入均质袋中，用均质机均质100 s.参考6×6点样法[13]，取100 μL菌悬液按1∶10进行倍比稀释，选取4个合适的稀释度，取10 μL菌悬液点在倒有培养基的平板上进行微生物测定，每个稀释度4个平行.每组样品做5次平行.放置在37 ℃恒温培养箱内培养.培养24 h后计数并记录数据.

1.3.3 肉色的测定 用色彩色差计进行肉色测定并依次记录亮度值(L*)，红度值 (a*).

1.3.4 pH值的测定 称取绞碎肉样10 g，加入100 mL蒸馏水，用回旋式振荡器振荡30 min，过滤后将滤液转移至100 mL的烧杯，用离子计测定滤液的pH值，记录数据.

1.3.5 电导率的测定 样品处理方法同1.3.4，用电导率仪测定滤液电导率值，记录数据.

1.4数据处理

试验数据采用Excel软件和Design Expert 7.0响应面软件处理.

2 结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1 细菌总数的变化 如图1所示，对于不同的气体比例气调包装下的冷却猪肉而言，细菌总数生长速度各有不同，对腐败的影响也有一定的差异.在初始条件基本一致的条件下，含有20%CO2的气调包装冷却猪肉生长速度最快，第6天时细菌总数已经超过106cfu·g-1，对应感官评定结果，到第8 d就有异味了，在贮藏12 d时细菌总数达到7.76 log (cfu·g-1)，说明货架期为6 d.CO2体积分数在20%～40%时，细菌总数的生长逐渐缓慢，40% CO2时最慢，30% CO2贮藏12 d细菌总数达到7.76 log(cfu·g-1)，40% CO2到16 d时细菌总数为8.31 log (cfu·g-1).相对于40% CO2的效果，50%和60%CO2的生长速度缓慢，但迟滞期较短，没有明显的延长冷却猪肉货架期的作用，50%和60%CO2在14 d时分别为8.21 log(cfu·g-1)和7.99 log(cfu·g-1).

图1 不同气体比例冷却猪肉细菌总数的变化

2.1.2 肉色的变化 如表1所示，对于不同的气体比例而言，随着贮藏时间的延长，生鲜猪肉的亮度在贮藏期间总体呈现上升的趋势.从表中可以明显的看到在整个贮藏期，40% CO2比其他组别的L*值低.而其他组别之间没有明显差别.20% CO2贮藏在10 d时突变为57.09，30%与40% CO2贮藏在14 d时分别为58.76和58.29.50%与60% CO2贮藏在16 d时分别为59.30和59.01.

在贮藏初期，a*值都会上升，这是因为气体比例中都含有氧气，使肉色变红(肌红蛋白的变化)，但是随着贮藏时间的延长都会下降，趋势都是相似的.30% CO2和40% CO2在整个贮藏期间的a*值都比较高，20% CO2贮藏2 d时a*值最高7.51，在第8 d下降.30% CO2贮藏在6 d时a*值最高9.29，在第8 d下降40% CO2贮藏在10 d时a*值最高9.75，在第12 d下降，50% CO2贮藏在6 d时a*值最高7.60，在12 d下降.60% CO2贮藏在4 d时a*值最高9.23，在第8 d下降，说明30%～40% CO2对肉样具有很好的护色作用.

表1 冷却猪肉颜色的测定结果

2.1.3 pH值的变化 屠宰后的畜肉，由于本身肌肉组织细胞的呼吸活动，在贮藏初期，不同肉样的pH值由于肌糖原的无糖酵解和ATP的分解，乳酸和磷酸的含量增加，使pH值略有下降，而后常规条件下基本上都随着贮藏时间的延长逐渐升高，但在气调包装中由于CO2与汁液接触，形成碳酸而降低了pH值.如图2所示，但不同的气体比例对pH值产生的影响也具有一定的差异.刚宰后的热鲜肉pH值约为7.0，经24 h降至5.6～6.0，并一直维持到肉腐败分解之前.本次试验中所选取的样品是在包装前已经完成了成熟过程，试验的肉样初始pH值基本一致在5.4～5.8，在贮藏过程中肉类蛋白质被微生物的蛋白分解酶分解成胺类等碱性含氮物，使pH值升高，但是CO2的作用使得pH值降低.

如图2所示，所有组别的pH值都没有太大的波动，因为包装中含有CO2，所以pH值一直都处于5～6，40% CO2时pH值最低，其他都稍微有所升高.说明在40%CO2时达到了很好的抑菌效果.

2.1.4 电导率的变化 如图3所示，在5组气调包装冷却猪肉肉浸出液的电导率值都是随天数的增加而不断增加.这说明随着时间的延长，肌肉中的导电物质不断增加，这是肌肉中带电物质不断分解的结果.20% CO2与30% CO2基本相似，20%CO2贮藏12 d时电导率为0.071S·m-1， 30%CO2和40% CO2贮藏14 d时电导率值分别为0.084 S·m-1和0.096 S·m-1.但是50% CO2与60% CO2的电导率值明显比较大，50% CO2贮藏14 d时电导率值达到0.14 S·m-1，60% CO2贮藏12 d时电导率值达到0.144 S·m-1.说明随着CO2比例的增加，汁液损失越多，溶出很多带电物质，导致电导率增加.很多人用电导率作为猪肉新鲜度的指标，电导率值确实可以反映腐败的进程.

图2 不同气体比例冷却猪肉pH值的变化

综合各个指标发现气体比例为40%CO2+40%O2+20%N2时效果较好.

图3 不同气体比例冷却猪肉电导率的变化

2.2响应曲面优化气体比例

根据中心复合设计试验(Central Composite Design， CCD)原理[12]，采用统计分析软件Design Expert 7.0进行中心复合设计试验.设CO2(A),O2(B)2个因素为自变量，细菌总数(Y1)，L*(Y2)，a*(Y3)，pH值(Y4)，电导率(Y5)分别为响应值，以此来优化气调包装冷却猪肉的比例，并通过Design Expert软件对试验数据进行回归分析，预测最佳比例[13].设计内容如表2,3所示.

表2 设计因素及其水平表

2.2.1 基于细菌总数优化气体比例 利用Design Expert 7.0软件，将细菌总数(Y1)进行二次多元逐步回归拟合，得出回归方程(1).

Y1=5.61-0.25A+0.73B-0.085AB+0.32A2+1.04B2

(1)

表3 2因素5水平实验设计气体比例

对回归模型进行方差分析(表4)，结果表明，回归模型的P<0.05，模型的相关系数R2=0.887 7，R2越接近1，说明试验模型与真实值之间的相关性越好.此模型可解释81%的变异，拟合度良好，具有实践指导意义.从A项、B项、A2项、B2项的数值和对比来看，二氧化碳和氧气对细菌总数都有影响，但氧气的影响明显大于二氧化碳.正的平方项系数所对应的抛物线开口向上，可以取得最小值，可进行优化分析.由此优化的气体比例为：CO239%+O237%+N224%.

2.2.2 基于L*值优化气体比例 将L*(Y2)的数据进行二次多元逐步回归拟合，得到优化气体比例的最优值的二次多项回归方程(2).

Y2=52.03-1.17A+1.41B+0.77AB+1.32A2+1.97B2

(2)

表4 细菌总数的回归方程的方差分析

对回归模型进行方差分析(表5)，结果表明，回归模型的P<0.05，模型的相关系数R2=0.915 1，模型预测值与真实值之间的相关性好.此模型可解释85%的变异，拟合度良好.从A项，B项、A2项、B2项的对比来看，氧气的影响大于二氧化碳的影响.正的平方项系数所对应的抛物线开口向上，可以取得最小值，可进行优化分析.由此优化的气体比例为：CO233%+O239%+N228%.

图4CO2和O2对应的细菌总数值的等高线图和响应曲面图

Fig.4ThecontourmapandresponsesurfaceplotofCO2andO2tothetotalbacteria

表5 L*值的回归方程的方差分析

图5 CO2和O2对应的L*值的等高线图和响应曲面图

2.2.3 基于a*值优化气体比例 将a*(Y3)的数据进行二次多元逐步回归拟合，得到优化气体比例的最优值的二次多项回归方程(3).

Y3=9.26-0.16A+0.013B-0.55AB-1.15A2-1.27B2

(3)

对回归模型进行方差分析(表6)，结果表明，回归模型的P<0.05，模型的相关系数R2=0.908 1，预测值与真实值之间的相关性好.此模型可解释84%的变异，拟合度良好.从A项、AB项、A2项、B2项的对比来看，氧气的影响远远大于二氧化碳的影响，而冷却猪肉的红度值与氧含量相关，氧气主要氧合肌红蛋白，促使肉品保持鲜红肉色.由图3可以看出，负的平方项系数所对应的抛物线开口向下，可以取得最大值，则可进行优化分析.由此得出的优化气体比例为：CO243%+O237%+N220%.

表6 a*值的回归方程的方差分析

图6 CO2和O2对应的a*值的等高线图和响应曲面图

2.2.4 基于pH值优化气体比例 将pH值(Y4)进行二次多元逐步回归拟合，得到优化气体比例最优值的二次多项回归方程(4).

Y4=5.58+0.091A-0.042B-003AB-0.035A2+0.13B2

(4)

对回归模型进行方差分析(表7)，结果表明，回归模型的P<0.05，模型的相关系数R2=0.964 1，预测值与真实值之间的相关性好.此模型的校正R2为0.938 4，可解释94%的变异，说明此模型拟合度很好.正的平方项系数比负的平方项系数的绝对值大，但响应曲面仍可取的最小值，可进行优化分析.由此优化的气体比例为：CO237%+O241%+N222%.

表7 pH值的回归方程的方差分析

图7CO2和O2对应的pH值的等高线图和响应曲面图

Fig.7ThecontourmapandresponsesurfaceplotofCO2andO2topH

表8 电导率的回归方程的方差分析

2.2.5 基于电导率值优化气体比例 将电导率(Y5)进行二次多元逐步回归拟合，得到优化气体比例最优值的二次多项回归方程(5)(其中A为CO2，B为O2).

Y5=763.00-22.44A-2.49B+43.75AB+222.63A2+271.38B2

(5)

结果表明，回归模型的P<0.000 1，模型的相关系数R2=0.993 0，此模型拟合度非常好.在方差分析中，正的平方项系数表明，方程的抛物线开口向上，具有极小值点，可进行优化分析.由此优化气体比例为：CO232%+O240%+N228%.

肉类富含蛋白质、脂肪、矿物质和维生素等营养物质，是高度容易腐烂变质的产品，虽然低温条件下一些微生物生长受到抑制，但是仍然存在大量不同种类的微生物.气体比例对冷却猪肉中微生物的生长影响非常大，很多学者是通过单一的气体含量进行研究[14,15],本研究探讨的是CO2与O2比例的保鲜效果，这样更接近实际情况，更清楚地了解CO2与O2相互作用下冷却猪肉的保鲜效果.CO2与 O2比例为1∶1时红度值较高，说明护色效果很好，有学者报道O2超过35%时，颜色效果较好，超过45%时则效果不明显，可能是由于肉表面氧化肌细胞色素的饱和所致[16].不同含量的CO2对pH值有一定的影响，而随着CO2含量的升高，溶出物质增多，会导致电导率有所波动，有不少学者认为电导率可以作为新鲜度指标[17,18].综合各个指标进行响应面分析，得出的结果更有利于实际生产和应用.

图8 CO2和O2对应的电导率值的等高线图和响应曲面图

3 结论

本研究建立和优化了细菌总数、L*，a*，pH值和电导率的逐步回归模型，各个模型均具有显著性，可为实际应用提供理论依据.通过回归方程优化了气体比例，CO2介于32%～43%，O2介于37%～41%，其余为相对应的N2，冷却猪肉在贮藏期间可保持良好品质.

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