杜宝宝， 樊明明， 赵宝磊， 田书苗， 冯建新， 刘忠虎

(1.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002；2.河南省水产科学院，河南 郑州 450044)

哺乳动物血细胞发生的器官是骨髓、胸腺和脾脏，在一定条件下肝脏也具有造血功能.然而鱼类是水生低等脊椎动物，与哺乳动物相比，其主要的血细胞发生器官为头肾、体肾和脾脏.根据鱼类血细胞的形态、染色、细胞质中细胞器的种类以及颗粒的形态，同时参照哺乳动物相关血细胞分类方法可将鱼类的血细胞分为红血细胞和白血细胞.其中，白血细胞包括淋巴细胞、血栓细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、浆细胞和巨噬细胞等[1].国内学者已对暗纹东方鲀[2]、长吻鮠[3]、草鱼[4]、南方鲶[5]、大弹涂鱼[6]、泥鳅[7]、军曹鱼[8]、美国红鱼[9]等鱼类血细胞的发育及发生过程进行了研究.淇河鲫鱼作为河南省境内特有的名优地方鱼类，为天然三倍体，与普通淡水鲫鱼相比，其色泽略呈金黄，体型丰满，背脊厚度为一般鲫鱼的2倍(俗称双背鲫).目前，关于淇河鲫鱼的养殖技术[10]、消化生理[11]和遗传特征[12,13]等均有相关的文献报道，但是对其血细胞发生的研究尚未见相关报道.本研究对淇河鲫鱼各个阶段血细胞的形态特征及其在造血器官中的发生过程进行了观察，以期为鱼类血液学研究提供依据.

1 材料与方法

1.1材料

试验用健康淇河鲫鱼体长 90～130 mm，体重 25.5～47.3 g.由国家水产资源平台安阳淇河鲫鱼国家级水产种质资源保护区提供，充氧运回实验室，置于水温25 ℃的养殖箱中充气预养7 d后用于实验操作.

1.2方法

1.2.1 血涂片及脏器印片的制备 1 mL注射器抽取尾静脉血液，常规方法制作血涂片.解剖鱼体，迅速取出头肾、体肾、脾脏.解剖剪分别剪出头肾、体肾、脾脏的横截面，每个横截面在洁净的载玻片上轻轻印6个印迹面.涂片及印片在空气中干燥，甲醇固定5 min，Wright-Giemsa染液(台资珠海贝索生物技术有限公司)按照操作说明进行染色.

1.2.2 观察与测量分析 在生物显微镜(BA310 DIGITAL C，MOTIC，厦门)下对脏器印片及血液涂片进行观察，采集清晰的细胞图像(Motica advance 3.2成像系统).测量的不同发育阶段各种细胞(每种细胞测量100个)的数据用SPASS分析软件进行分析.

2 结果与分析

2.1血细胞的发生和分类

淇河鲫鱼血不同发育阶段各种细胞的统计结果见表1. 3种组织印片中各种不同发育阶段的细胞分类计数结果和比例见表2.根据观察结果显示(图1～图6)，淇河鲫鱼的血细胞可以分为红细胞系、粒细胞系、单核细胞系、淋巴细胞系及其他血细胞.这些血细胞经过原始阶段、幼稚阶段最终发育为成熟的血细胞.

2.1.1 红细胞系 原红细胞(Proerythroblast，PE)：细胞呈圆形或椭圆形，胞体直径为(15.47±1.52)μm × (13.97±1.46 )μm，细胞质较少，染色呈深蓝色，常在核周围形成1个狭窄的深蓝色环带区.胞核直径为(11.94±1.68)μm ×(10.42±1.63)μm，占细胞的绝大部分，居中或偏于细胞一侧，核内染色质染成深紫红色.早幼红细胞(Basophilic Erythroblast，BE)：细胞呈圆形或椭圆形，胞体直径为(9.65±1.39)μm ×(8.27±1.27)μm，细胞核直径为(7.70±0.89) μm×(6.66±0.83)μm，胞体和胞核均比原红细胞小.胞质内出现血红蛋白，随着细胞的发育，胞体逐渐变小，胞质颜色由深蓝色逐渐变为浅蓝色或灰蓝色，细胞核内的染色质逐渐变粗呈车轮状排列.幼红细胞(Orthrochromic Erythroblast，OE)：细胞呈圆形或椭圆形，胞体直径为(6.06±0.79)μm ×(5.12±0.51)μm.随着细胞的发育胞质由灰蓝色逐渐变为桔红色，胞质和血红蛋白含量增多，嗜酸性逐渐增强，胞核更加致密.成熟的红细胞(Erythrocyte，ER)：细胞呈长椭圆形或圆形，胞体较大，直径为(13.58±1.93)μm ×(8.04±1.09) μm.胞质丰富，内部充满血红蛋白，呈桔红色，着色均匀.胞核居中，直径为(6.60±0.64)μm ×(3.82±0.58)μm，致密呈长扁圆形，染色呈蓝紫色.

表1 淇河鲫鱼各类血细胞的大小

2.1.2 淋巴细胞系 原淋巴细胞(Primitive Lymp-hoblast，PL)：细胞很小，直径为(9.15±1.01)μm ×(7.84±1.19)μm，是最小的原血细胞.在体肾、脾脏的印片中均能发现.细胞呈现圆形或卵圆形，胞质较少，染成蓝色或灰蓝色.细胞核直径为(7.19±1.07)μm ×(5.99±1.03)μm，呈圆形或椭圆形几乎占据细胞全部，有时偏位.核染色质呈深紫红色.幼淋巴细胞(Immature Lymphocyte，IL)：细胞圆形或不规则圆形，具有钝形胞突.细胞质呈现蓝色或淡蓝色，量少.胞核仍占细胞大部分，圆形或椭圆形，偶呈不规则形；核染色质呈紫红色.成熟淋巴细胞：根据胞体大小可将其分为大淋巴细胞(Large Lymphocyte，LL)和小淋巴细胞(Small lymphocyte，SL)2种.小淋巴细胞的胞体直径为(4.65±0.34)μm×(4.13±0.38)μm，呈圆形或椭圆形，细胞质很少，染色呈淡蓝色.胞核圆形或豆形，直径为(3.99±0.33)μm ×(3.48±0.38)μm，占细胞的大部，核染色质凝缩，染成蓝紫红色.大淋巴细胞的胞体直径为(6.52±0.67)μm ×(5.60±0.70)μm，与小淋巴细胞一样也具有胞突，细胞质染成蓝色或淡蓝色，核染色质呈现淡紫红色，比较疏松.

表2 3种组织印片中各种不同发育阶段的细胞分类计数结果

PE. 原红细胞；BE. 早幼红细胞；OE. 晚幼红细胞；ER. 红细胞；PL. 原淋巴细胞；IL. 幼淋巴细胞；LL. 大淋巴细胞；SL. 小淋巴细胞；PM. 原单核细胞；IM. 幼单核细胞；MO. 单核细胞；EIG. 早幼粒细胞；NE. 中性粒细胞；MIE. 中幼嗜酸性粒细胞；EO. 成熟嗜酸性粒细胞.

EIG.早幼粒细胞；MIN.中幼嗜中性粒细胞； MP.巨噬细胞；SL.小淋巴细胞；IL.幼淋巴细胞；NE.中性粒细胞；THR.血栓细胞；EO.成熟嗜酸性粒细胞.

MP.巨噬细胞；THR.血栓细胞；SL.小淋巴细胞；ER.红细胞；PG.原粒细胞.

箭头所示为杆状物

箭头所示为正在分裂的红细胞

BO.嗜碱性粒细胞

2.1.3 单核细胞系 原单核细胞(Primitive Monocyte，PM)：胞体直径为(16.03±1.68)μm ×(14.28±1.65)μm，圆形或不规则形；胞质较丰富，蓝色或灰蓝色，胞质内有空泡.细胞核形态多样，有的呈肾形扭曲，有的偏一侧而扭曲折叠，有的呈瘤状突出，也有圆形或椭圆形、一侧稍凹陷；核染色质呈浅紫红色纤细网状，分布不均.幼单核细胞(Immature Monocyte，IM)：细胞形状有椭圆形或不规则圆形，胞体直径为(16.65±1.62)μm×(14.67±1.51) μm，较原单核细胞大，胞质丰富，染成灰蓝色，内部有明显空泡，胞质内有嗜天青颗粒.胞核呈圆形或不规则形，染色质形成紫红色的疏松网状结构.成熟单核细胞(Monocyte，MO)：细胞常呈椭圆形或不规则形，直径为(17.41±2.18)μm ×(15.37±1.82)μm.细胞质丰富，呈淡灰蓝色，染色不均匀，胞质内有大小不等的空泡.细胞核较大为(12.78±1.88)μm ×(10.18±1.36)μm，呈椭圆形或不规则形，位于细胞一侧，占整个细胞的三分之一以上，染色质呈紫红色疏网状结构.

2.1.4 粒细胞系 原粒细胞(Primitive Granulocyte，PG)：细胞呈圆形或椭圆形，直径为(11.93±1.24)μm ×(10.59±0.97)μm.细胞质染成浅蓝色着色均匀.胞核圆形或椭圆形，直径为(8.38±1.10)μm×(6.93±1.02)μm，居中或偏位；核染色质呈浅紫红色细沙粉末状，分布均匀.早幼粒细胞(Early Immature Granulocyte，EIG)：胞体圆形或椭圆形，直径为(11.88±1.06)μm ×(10.79±1.09)μm.胞质浅蓝色，胞质中的颗粒较原粒细胞丰富.细胞核呈卵圆形，偏于一侧，染色质较粗，分布不均匀.中幼嗜中性粒细胞(Middle Immature Neutrophil，MIN)：胞体圆形或椭圆形，直径为(12.21±1.33)μm ×(10.85±1.15)μm.细胞质较多，染成浅蓝色，特异性的嗜中性颗粒大量增多，这种颗粒着色较浅，呈淡粉红色，分布均匀.细胞核呈椭圆形，偏于细胞一侧，染色质呈现蓝紫色，比较密集.成熟嗜中性粒细胞(Neutrophil，NE)：细胞呈圆形或椭圆形，胞体直径为(12.05±1.29)μm ×(10.65±1.07)μm，胞质内有细小特异性的嗜中性颗粒.核呈肾形或圆形，有时会出现分叶的情况，常常偏于细胞一侧或与质膜相切.染色质显紫红色，致密，呈块状.中幼嗜酸性粒细胞(Middle Immature Eosinophilic Granulocyte，MIE)：细胞呈圆形或椭圆形，胞体直径为(11.46±1.18)μm ×(10.17±1.08)μm，比中幼嗜中性粒细胞小.胞质淡蓝色，内有红色的嗜酸性颗粒出现.核呈椭圆形或不规则，占整个细胞一半，偏于细胞的一侧，核内染色质呈深紫红色粗网状.成熟嗜酸性粒细胞(Eosinophilic Granulocyte，EO)：胞体圆形或椭圆形，直径为(12.56±1.28)μm×(11.32±1.22)μm.胞质内充满红色的嗜酸性颗粒.胞核呈圆形或椭圆形，偏于细胞一侧，与质膜相切，核内染色质更为浓密，呈深紫红色团块状.

2.1.5 其他血细胞 血栓细胞( Thrombocyte，THR)：又称为凝血细胞，胞体较小，胞体直径为(4.75±0.55)μm ×(4.28±0.53)μm，呈圆形或椭圆形，一部分为纺锤形.细胞核呈圆形，直径为(3.47±0.46)μm ×(3.08±0.42)μm，占据整个细胞，有时会出现裸核，核内染色质呈暗紫红色，致密.胞质极少，呈淡紫色，以薄环状围绕胞核，有的分辨不清.血栓细胞在外周血液中常常出现集群现象.巨噬细胞( Macrophage，MP)：鱼类最大的血细胞，它由单核细胞发育形成.胞体呈现不规则的类圆形，直径为(25.99±1.64)μm ×(21.72±1.84)μm.胞质浅蓝色，着色不均匀，胞质中有较多空泡散乱分布.胞核呈现椭圆形或类圆形，偏于细胞一侧，核中染色质染色较浅，呈细沙状分布.零星分布在头肾、体肾、脾脏中，在细胞周围常有淋巴细胞、粒细胞和血栓细胞等镶嵌.杆状物(图4箭头所示)：在外周血涂片和脏器印片中发现了一些存在于细胞质和细胞外的杆状物质，染色呈蓝色，一般呈群集现象.嗜碱性粒细胞(Basophil，BO)：为鱼类血液中含量最少的细胞.细胞呈圆形，胞核分叶不清楚，位于一侧，胞质内含形状不规则、大小不等的蓝色嗜碱性颗粒.

3 讨论

3.1淇河鲫鱼血细胞发育的特点

1)红细胞的发育.红细胞的发育成熟过程中经历了原红细胞、幼红细胞、红细胞3个阶段.由上述统计数据可以看出红细胞在发育的过程中胞体体积经历了由大变小，再变大的变化.这一变化与暗纹东方鲀[2]、淡水石斑鱼[1]、军曹鱼[8]、兴国红鲤[15]以及美国红鱼[9]等的发育过程相同.细胞核内的染色质不断凝集固缩，着色由淡紫红色到深紫红色逐渐加深，并且细胞核存在于整个发育的过程中与哺乳动物特化的红细胞不同.细胞质由少到多，染色由蓝色逐渐变为桔红色，为血红蛋白含量逐渐增加的结果.另外，在淇河鲫鱼外周血涂片中还观察到了正在分裂的红细胞，这说明红细胞除了能在造血器官中生成外，也可以通过有丝分裂得到补充.2)淋巴细胞的发育. 淋巴细胞的发育过程经历了原淋巴细胞、幼淋巴细胞和淋巴细胞三个阶段.根据统计结果可以看出，淋巴细胞在发育的过程中细胞体积由大变小，这与美国红鱼[9]、草鱼[4]、军曹鱼[8]、长吻鮠[3]等的变化相同,而与淡水石斑鱼[14]的由小变大再变小不同.染色质逐渐凝集固缩，染色加深.细胞质的量少并且染色逐渐变浅.成熟的淋巴细胞可以分为大、小淋巴细胞，小淋巴细胞胞质的嗜碱性比大淋巴细胞的强.3)单核细胞的发育 . 其发育过程分为原单核细胞、幼单核细胞和成熟单核细胞三个阶段.在发育的过程中细胞体积逐渐变大，这与兴国红鲤[15]的由大变小，与带石斑[16]、大弹涂鱼[6]的由大变小再变大，与花尾胡椒鲷[17]、草鱼[4]的由小变大再变小的变化规律都不相同，这可能是种间差异造成其不同的发育过程.胞质颜色由灰蓝色到淡灰色，染色质由细疏网状到粗疏网状.4)粒细胞的发育 . 粒细胞的发育经过了原粒细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞、成熟粒细胞五个时期，其发育过程复杂.数据显示，原粒细胞在发育成幼粒细胞的过程中，胞体变小，在进一步发育成熟的过程中，胞体逐渐变大，胞核由圆形变成半圆形，再变成肾形，最后变成分叶状、杆状.胞质中由无颗粒变成有颗粒，在中性早幼粒细胞中出现最早的为嗜天青颗粒，在进一步分化成熟的过程中，嗜天青颗粒逐渐减少而嗜酸性颗粒和嗜中性颗粒逐渐增多.另外在淇河鲫鱼的脏器印片中还发现了少量的嗜碱性粒细胞.

3.2血细胞的发生场所

鱼类的造血器官因鱼种而异[18].统计数据显示，淇河鲫鱼的头肾、体肾和脾脏印片中均能观察到原始阶段的红细胞、粒细胞、单核细胞和淋巴细胞.原红细胞和原淋巴细胞在头肾中的比例最高分别为0.36%和6.02%，在体肾中分别为0.29%和3.61%.原粒细胞和原单核细胞也主要存在于头肾和体肾中.在脾脏中观察到的各类型的原始阶段的血细胞数量很少，但是在在外周血涂片上未观察到上述各类型细胞，这表明头肾和体肾是淇河鲫鱼血细胞发生和发育的的主要场所.血栓细胞在外周血液中群集分布，且在印片中未发现其发育的原始阶段细胞.

参考文献：

[1]周 玉, 郭文场, 杨振国. 鱼类血细胞的研究进展[J]. 动物学杂志, 200l, 36(6): 55-58.

[2]顾曙余, 赵壁影, 杨家新. 暗纹东方鲀血细胞发生的观察[J]. 淡水渔业, 2007, 37(1): 13 - 18.

[3]金 丽, 张耀光. 长吻鮠血细胞发生的研究[J].水生生物学报, 2007, 31(6): 807-815.

[4]郭琼林, 卢全章. 草鱼肾脏和脾脏血细胞发育过程的观察[J]. 水生生物学报，1993, 17(1): 40-45.

[5]陈晓耘. 南方鲶幼鱼血细胞发生的研究[J]. 西南师范大学学报：自然科学版, 2000, 25(3): 281-287.

[6]李长玲, 曹伏君, 刘楚吾，等. 大弹涂鱼血细胞发生的研究[J]. 中国水产科学, 2001, 8(1): 10-14.

[7]肖义军, 金雅平, 郑翠芳，等. 泥鳅头肾、脾脏和肝脏中血细胞发生的观察[J]. 福建师范大学学报：自然科学版, 2001, 17(3): 65-69.

[8]陈 刚, 周 晖, 张健东，等. 军曹鱼血液指标及血细胞发生的观察[J]. 水生生物学报, 2005, 29(5): 564-570.

[9]陈 刚, 周 晖, 叶富良，等. 美国红鱼血细胞观察[J]. 热带海洋学报, 2006, 25(2): 59-65.

[10] 路志鸣，贾荣利. 淇河鲫鱼大规格鱼种培养技术[J]. 中国水产，2006(9): 41-42.

[11] 高春生，齐子鑫，范光丽，等. 淇河鲫鱼消化酶活性研究[J]. 水利渔业，2006, 26(1): 7-8.

[12] 冯建新，张西瑞，周晓林,等. 淇河鲫鱼的RAPD标记及遗传多样性[J]. 海洋湖沼通报，2003(4): 90-94.

[13] 李斌顺，何军功. 淇河鲫鱼三倍体与二倍体共存质疑[J]. 河南水产，2013(2): 8-9.

[14] 顾曙余, 杜 寅. 淡水石斑鱼血细胞发生的观察[J]. 水产科学, 2008, 27(4): 179-183.

[15] 林光华, 林 琼, 洪一江,等. 兴国红鲤血细胞发生的研究[J]. 动物学报, 1998, 44(4): 488-489.

[16] 周 晖, 陈 刚, 张健东，等. 斜带石斑鱼血细胞发生的观察[J]. 湛江海洋大学学报, 2006, 26(4):3-7.

[17] 李长玲, 曹伏君, 刘楚吾，等. 花尾胡椒鲷肾脏和脾脏血细胞发育的研究[J]. 热带海洋学报, 2002, 21(3): 7 -13.

[18] 赵凤岐, 曹谨玲. 硬骨鱼血细胞发生的研究进展及经济前景分析[J]. 中国渔业经济, 2007( 3): 30-33.