刘茂柯，唐玉明，曹晓涵，任道群，姚万春，敖晓琳

（1.四川省农业科学院水稻高粱研究所生物中心，四川泸州646100；2.四川农业大学生命科学与理学院，四川雅安625014；3.四川农业大学食品学院，四川雅安625014）

近年来，随着微生态技术的发展，益生菌应用于食品、药物的成果日益增加，新产品层出不穷。然而，由于活菌数对益生菌产品功效具有基础性作用，使得相关产品的研发主要致力于如何提高活菌数，而易忽视制造工艺对益生菌健康效应存在的巨大影响[1]。还有研究显示，制造过程中若盲目追求提高益生菌活菌数，可能会导致健康效应的衰退，降低产品功效[2]。因此，除活菌数外，应对产品制造过程中影响益生菌健康效应的其他因素投入更多的关注，合理调整工艺，方能使益生菌在宿主体内更高效地起到有益效果，推动益生菌产品的功效朝所期待的方向发展。

1 制造工艺对益生菌健康效应的影响

1.1 生长培养基

益生菌健康效应的体现高度依赖对生长培养基的选择。不同培养基培养的益生菌在拮抗病原菌[3]、免疫调节[4]和降解胆固醇[5]等方面的能力均有差异。例如，M17培养的L.lactis G50诱导小鼠巨噬细胞产生干扰素IL-12的能力显著强于MRS培养[4]，而在MRS中生长的L.johnsonii NCC 533对沙门氏菌的拮抗作用明显高于MLM+培养[6]。

培养基营养成分的不同可改变益生菌代谢途径，造成细胞表面与生理功能相关的糖蛋白、脂肪酸等分子种类、构象发生变化进而造成健康效应的差异。如在生长培养基中添加不同的碳源、氮源以及无机盐可影响抗菌素的生成，使菌株显示出不同的拮抗能力[3，7]。而添加不同脂肪酸可能导致菌株细胞表面非饱和与饱和脂肪酸的比率发生变化，改变细胞膜疏水性，影响肠道黏附性和拮抗能力[6]。

1.2 pH

培养pH对益生菌健康效应有很大影响。一方面，培养pH的变化可影响相关代谢产物的合成与分泌。例如，抗菌素的产生对pH具有高度易感性，使得不同pH条件下培养的菌株拮抗能力有所不同[3，7]。还有研究证实，与益生菌耐胆盐和降解胆固醇能力相关的胆酸盐水解酶的活性[8]以及具有肿瘤生长抑制作用的精氨酸脱亚胺酶的分泌[9]也高度依赖pH的调控。另一方面，Sashihara等[10]认为培养环境中的H+对肽聚糖的构象可能起到修饰作用，从而影响菌株免疫调节功能。在他们的研究中，不同pH培养的L.gasseriOLL2809诱导小鼠脾细胞白介素IL-12（P70）的分泌量分别约为：500 pg/mL（pH6）、1000pg/mL（pH5）、1800pg/mL（pH4）。

1.3 生长期

益生菌在不同生长期健康效应的作用机理不同[11-13]。如Maassen等[11]分别向小鼠饲喂对数期和生长期的乳酸菌后接种疫苗，两个处理间血清IgG1/IgG2a比率呈现显著差异，表明不同生长期乳酸菌可能决定疫苗诱导的免疫应答是偏向于Th1还是Th2型，进而造成免疫应答类型的不同。目前的研究显示，益生菌在稳定期时，其黏附[13]、拮抗[3]与免疫调节能力[10]相对较强，原因是细胞表面物质如疏水性蛋白、聚糖类物质等均在此时分化成熟。此外，稳定期不同时间点收获的菌株各方面表现也不同。例如L.rhamnosus GG对Caco-2黏附性以稳定期前期最强[13]。而L.gasseri OLL2809诱导鼠脾细胞白介素IL-12（P70）的分泌量在稳定期后期达到最高[10]。

1.4 培养温度

已有研究显示，培养温度对益生菌抗菌能力有较大影响。如在20、30、40℃条件下培养的L.rhamnosus GP1对哈氏弧菌的抗菌效价分别为420、1 200 AU/mL与200 AU/mL[7]。而有关培养温度对其他健康效应有何影响的报道较少。现已证实培养温度对胞外多糖（EPS）的富集有显著影响[14]，而胞外多糖在益生菌黏附、免疫调节与消除细胞病变中起重要作用[15-17]，但尚缺乏直接的证据将两者联系起来。

1.5 载体

研究显示，与不同载体配伍，益生菌在治疗关节炎[18]、抑制幽门螺杆菌[19]以及抗肿瘤[20]等方面的表现不同。说明了载体对健康效应存在影响，但相关作用机理尚不清楚。可能的机理之一是载体可降低不利环境因素的胁迫作用对益生菌生理功能造成的伤害，使活菌数和细胞结构得以保持。Saxelin等[21]将复合益生菌制成胶囊、酸奶酪与干酪3种形式，让成年人以1010cfu/d的剂量服用四周，停用后各处理粪便中B.lactis Bb12活菌数呈现出极显著的差异，揭示了载体对定植力的影响。还有研究显示将益生菌与脱脂乳配伍，脱脂乳中的蛋白质可分散高压匀浆过程中的压力，降低其对细胞膜疏水性造成的影响，使黏附性得到保持[22]。

另一可能的机理是载体所含的生物活性物质与益生菌之间存在协同作用。Larsen等[23]在体外试验中发现Ca2+可促进益生菌黏附性和拮抗能力增强。Sachdeva等[19]在研究中指出，以富含Ca2+的乳制品为载体可使益生菌在人体内对幽门螺杆菌的抑制作用较其他载体提升5%到10%。这可能也是目前益生菌食品主要以乳制品为载体的原因之一。

1.6 其他

Vinderola等[24]发现不同香型发酵乳制品中L.casei的胃肠道耐受性有较大差异。因此，他推测食品添加剂对健康效应有一定影响，但他检测的样品来源于不同厂商，这种差异是否仅由香味剂所引起尚有待证实。此外，对于复合益生菌产品，菌株配伍方式也存在较大影响。例如，将B.lactis Bb12与L.rhamnosusGG进行配伍，可使L.rhamnosus GG的肠道黏附性显著提高，免疫调节效应得到加强[25]。但若将L.rhamnosus LC705或B.breve Bb99与其进行组合，则可能导致完全相反的结果[26]。

2 益生菌产品研发应注意的问题

益生菌产品功效主要取决于活菌数基础上菌株健康效应的展现。然而制造工艺对健康效应存在的巨大影响，可能产生某一工艺措施在提高活菌数的同时却导致健康效应的衰退，这是易被忽视的问题。

研究发现，对数期的L.rhamnosus GG抗逆性显著强于稳定期[27]，但此时其肠道黏附性相对于稳定期时却显著下降[13]。若将对数期的培养物用于产品研发，虽利于活菌数的提高，但也可能减弱其免疫调节效应。Burns等[2]的研究印证了这一观点。他们发现，对L.lactis 200进行耐胆盐驯化虽可提高其肠道存活率，但会造成细胞膜完整性的缺失，使疏水性和凝集作用下降，导致免疫调节效应受损。因此，对工艺的调整应考虑到对活菌数和健康效应的兼顾，做到全局优化。例如，酸驯化可促进细胞膜饱和脂肪酸的富集提高菌株抗逆性[28]，但脂肪酸结构的改变将导致细胞膜疏水性变化，影响到肠道黏附性[6]。生长培养基中添加甘露糖可提高菌株冻干和存储期的活菌数[29]，同时这对抗菌素的产生[3，7]、EPS[30]的形成将带来何种影响都是须注意的问题。

因此，若能在深入解析益生菌生理功能的基础上，将相关作用机制灵活应用于对制造工艺的优化中，目的和手段有效结合，有所兼顾，有的放矢，方能使益生菌产品的功效得到增强。

3 如何提高益生菌产品的功效

3.1 利用健康效应的作用机制

益生菌健康效应的展现主要与细胞表面物质、代谢产物以及特殊DNA序列有关[31]。调整工艺使相关作用机理得以保持是提升产品功效的有效措施。例如，Sashihara等[10]指出虽然在pH 5.5～6.5环境下培养有利于获得益生菌细胞产量和初级代谢产物，但在此基础上适当降低pH并将益生菌培养至稳定期更有利于肽聚糖的成熟，使免疫调节效应得到提升。类似的结论在随后的研究中得到[3，13，32]。而 Roy 等[33]通过基因重组对益生菌细胞表面受体进行设计来阻断病原菌对肠道细胞的结合也取得了较好的效果。另外，对相关作用机理的研究应注重对共性的把握。其中，黏附性被认为是益生菌在体内发挥健康效应的关键，与之相关的细胞表面物质如EPS[15]、S-layer[34]以及菌毛蛋白[35]等是值得重点研究的对象。

3.2 利用抗逆性的生理机制

F1F0 ATPase是益生菌在逆境中维持自身内稳态的关键酶，研究显示通过耐酸[36]、耐胆盐[37]驯化均可促进此酶的表达与活性的提高进而提升菌株抗逆性。Ongol等[38]则采用新霉素诱变的方式来减弱L.bulgaricus中该酶的活性，降低乳制品后酸化作用，使B.breve的活菌数在存储期显著提高。这提示，深入研究益生菌抗逆性的生理机制，可为提升活菌数带来更多的工艺措施，使对工艺的选择更灵活、更具针对性。例如，L.rhamnosus是运用较广的益生菌，但由于其缺乏过氧化氢酶，使得相关产品的活菌数难以维持。An等[39]将该菌与L.sakei YSI8中表达过氧化氢酶的KatA进行重组，使其在有氧培养条件下活菌数提高100倍左右，同时健康效应也得到保持。

3.3 利用生理功能的相关性

利用益生菌生理功能的相关性，从侧面对菌株进行改造可为工艺调整提供更多的切入点。如前所述，适应性驯化提高菌株抗逆性的机制之一是其有利于F1F0 ATPase的表达与活性的提高。F1F0 ATPase的活性需消耗大量ATP来维持。因此，抗逆性较强的菌株往往伴随着相对旺盛的糖酵解能力[27]。所以，在适应性驯化可能损伤菌株健康效应时，借鉴Fu等[40]的方法通过代谢工程手段针对糖酵解途径进行调控来提高其抗逆性也是值得尝试的。同时，这也提示，优化培养条件提升益生菌抗逆性时，为其提供更多的营养物质可能会取得更好的效果。

3.4 加强产品临床效果研究

对大多数消费者而言，对益生菌产品的使用方式是影响其功效的主要因素。Tsai等[41]向小鼠饲喂L.paracasei NTU 101（108cfu/d），其拮抗与免疫调节效应在连续饲喂6周后才有所体现，连续饲喂9周后方能使健康效应在停饲后维持一段时间。这说明健康效应的展现具有时间依赖性，而使用时间长短还可能造成相关的作用机制发生转变[42]。然而目前临床研究的试验期普遍较短，尤其缺乏对益生菌健康效应随使用时间变化的动态结果，造成相关产品具体功效的标识不明确，间接导致了消费者对产品的使用方式具有随意性的特点，造成功效的不确定性。

3.5 完善产品质量评价体系

除活菌数外，应将肠道黏附性、拮抗、免疫调节等纳入质量评价体系当中，针对产品所标示的具体健康功效进行鉴定。此外，为避免因材料方法的不同导致对菌株功能评价结果出现差异，对鉴定方法的选择应具有多元化。

4 结语

目前，益生菌产品研发需要解决的问题是在深入解析益生菌生理功能的同时加大对制造工艺学的研究力度。在此基础上，合理兼顾益生菌活菌数与健康效应之间的关系，全局优化，这对提升益生菌产品的功效、推动益生菌产业的发展具有重要的理论和应用价值。随着相关研究的深入，益生菌产品将进一步发挥对人类健康的促进作用。

[1]Grzeskowiak L,Isolauri E,Salminen S,et al.Manufacturing process influences properties of probiotic bacteria[J].Br J Nutr,2011,105(6):887-894

[2]Burns P,Reinheimer J,Vinderola G.Impact of bile salt adaptation of Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis 200 on its interaction capacity with the gut[J].Research in Microbiology,2011,162(8):782-790

[3]Khalil R,Djadouni F,Elbahloul Y,et al.The influence of cultural and physical conditions on the antimicrobial activity of bacteriocin produced by a newly isolated Bacillus megaterium 22 strain[J].African Journal of Food Science,2009,3(1):011-022

[4]Kimoto-Nira H,Suzuki C,Kobayashi M,et al.Different growth media alter the induction of interleukin 12 by a Lactococcus lactis strain[J].Journal of Food Protection,2008,71(10):2124-2128

[5]Lye H S,Rahmat-Ali G R,Liong M T.Mechanisms of cholesterol removal by lactobacilli under conditions that mimic the human gastrointestinal tract[J].International Dairy Journal,2010,20(3):169-175

[6]Muller J,Ross R,Sybesma W,et al.Modification of the Technical Properties of Lactobacillus johnsonii NCC 533 by Supplementing the Growth Medium with Unsaturated Fatty Acids[J].Applied and Environmental Microbiology,2011,77(19):6889-6898

[7]Sarika A,Lipton A,Aishwarya M.Bacteriocin production by a new isolate of Lactobacillus rhamnosus GP1 under different culture conditions[J].Adv J Food Sci Technol,2010,2(5):291-297

[8]Kumar R,Grover S,Batish V K.Hypocholesterolaemic effect of dietary inclusion of two putative probiotic bile salt hydrolase-producing Lactobacillus plantarum strains in Sprague-Dawley rats[J].British Journal of Nutrition,2011,105(4):561

[9]Rimaux T,Rivière A,Illeghems K,et al.Expression of the arginine deiminase pathway genes in Lactobacillus sakei is strain-dependent and is affected by environmental pH[J].Applied and Environmental Microbiology,2012,78(14):4874-4883

[10]Sashihara T,Sueki N,Furuichi K,et al.Effect of growth conditions of Lactobacillus gasseri OLL2809 on the immunostimulatory activity for production of interleukin-12(p70)by murine splenocytes[J].International Journal of Food Microbiology,2007,120(3):274-281

[11]Maassen C,Boersma W J A,van Holten-Neelen C,et al.Growth phase of orally administered Lactobacillus strains differentially affects IgG1/IgG2a ratio for soluble antigens:implications for vaccine development[J].Vaccine,2003,21(21/22):2751-2757

[12]Van Baarlen P,Troost F J,Van Hemert S,et al.Differential NFKB pathways induction by Lactobacillus plantarum in the duodenum of healthy humans correlating with immune tolerance[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2009,106(7):2371

[13]Deepika G,Green R J,Frazier R A,et al.Effect of growth time on the surface and adhesion properties of Lactobacillus rhamnosus GG[J].Journal of Applied Microbiology,2009,107(4):1230-1240

[14]Aslim B,Yuksekdag Z N,Beyatli Y,et al.Exopolysaccharide production by Lactobacillus delbruckii subsp.bulgaricus and Streptococcus thermophilus strains under different growth conditions[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2005,21(5):673-677

[15]Fanning S,Hall L J,Cronin M,et al.Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2012,109(6):2108-2113

[16]Lebeer S,Claes I J J,Verhoeven T L A,et al.Exopolysaccharides of Lactobacillus rhamnosus GG form a protective shield against innateimmunefactorsintheintestine[J].MicrobialBiotechnology,2011,4(3):368-374

[17]Ruas-Madiedo P,Medrano M,Salazar N,et al.Exopolysaccharides produced by Lactobacillus and Bifidobacterium strains abrogate in vitro the cytotoxic effect of bacterial toxins on eukaryotic cells[J].Journal of Applied Microbiology,2010,109(6):2079-2086

[18]Baharav E,Mor F,Halpern M,et al.Lactobacillus GG bacteria ameliorate arthritis in Lewis rats[J].The Journal of nutrition,2004,134(8):1964-1969

[19]Sachdeva A,Nagpal J.Effect of fermented milk-based probiotic preparations on Helicobacter pylori eradication:a systematic review and meta-analysis of randomized-controlled trials[J].European journal of gastroenterology&hepatology,2009,21(1):45

[20]Urbanska A M,Bhathena J,Martoni C,et al.Estimation of the potential antitumor activity of microencapsulated Lactobacillus acidophilus yogurt formulation in the attenuation of tumorigenesis in Apc(Min/+)mice[J].Digestive diseases and sciences,2009,54(2):264-273

[21]Saxelin M,Lassig A,Karjalainen H,et al.Persistence of probiotic strains in the gastrointestinal tract when administered as capsules,yoghurt,or cheese[J].International Journal of Food Microbiology,2010,144(2):293-300

[22]Lanciotti R,Patrignani F,Iucci L,et al.Potential of high pressure homogenization in the control and enhancement of proteolytic and fermentative activities of some Lactobacillus species[J].Food chemistry,2007,102(2):542-550

[23]Larsen N,Nissen P,Willats W G T.The effect of calcium ions on adhesion and competitive exclusion of Lactobacillus ssp.and E.coli O138[J].International Journal of Food Microbiology,2007,114(1):113-119

[24]Vinderola G,Cespedes M,Mateolli D,et al.Changes in gastric resistance of Lactobacillus casei in flavoured commercial fermented milks during refrigerated storage[J].International Journal of Dairy Technology,2011,64(2):269-275

[25]Ouwehand A,Isolauri E,Kirjavainen P,et al.The mucus binding of Bifidobacterium lactis Bb12 is enhanced in the presence of Lactobacillus GG and Lact.delbrueckii subsp.bulgaricus[J].Lettersinapplied microbiology,2000,30(1):10-13

[26]Kukkonen K,Savilahti E,Haahtela T,et al.Long-term safety and impact on infection rates of postnatal probiotic and prebiotic(synbi－otic)treatment:randomized,double-blind,placebo-controlled trial[J].Pediatrics,2008,122(1):8-12

[27]Ampatzoglou A,Schurr B,Deepika G,et al.Influence of fermentation on the acid tolerance and freeze drying survival of Lactobacillus rhamnosus GG[J].Biochemical Engineering Journal,2010,52(1):65-70

[28]Broadbent J R,Larsen R L,Deibel V,et al.Physiological and transcriptional response of Lactobacillus casei ATCC 334 to acid stress[J].Journal of Bacteriology,2011,192(9):2445-2458

[29]Carvalho A S,Silva J,Ho P,et al.Effects of Various Sugars Added to Growth and Drying Media upon Thermotolerance and Survival throughout Storage of Freeze-Dried lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus[J].Biotechnology progress,2004,20(1):248-254

[30]Garrido D,Kim J H,German J B,et al.Oligosaccharide binding proteins from Bifidobacterium longum subsp.infantis reveal a preference for host glycans[J].PLoS One,2011,6(3):e17315

[31]Li Z,Li G,Liu H,et al.The analysis of the impacting factors of probiotics on immune responses[J].African Journal of Microbiology Research,2012,6(11):2735-2743

[32]Marianelli C,Cifani N,Pasquali P.Evaluation of antimicrobial activity of probiotic bacteria against Salmonella enterica subsp.enterica serovar typhimurium 1344 in a common medium under different environmental conditions[J].Research in Microbiology,2010,161(8):673-680

[33]Roy D S,Colin H.Rational Design of Improved Pharmabiotics[J].Journal of Biomedicine and Biotechnology,2009,doi:10.1155/2009/275287

[34]Konstantinov S R,Smidt H,De Vos W M,et al.S layer protein A of Lactobacillus acidophilus NCFM regulates immature dendritic cell and T cell functions[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2008,105(49):19474-19479

[35]Lebeer S,Claes I,Tytgat H L P,et al.Functional Analysis of Lactobacillus rhamnosus GG Pili in Relation to Adhesion and Immunomodulatory Interactions with Intestinal Epithelial Cells[J].Applied and Environmental Microbiology,2012,78(1):185-193

[36]Waddington L,Cyr T,Hefford M,et al.Understanding the acid tolerance response of bifidobacteria[J].Journal of Applied Microbiology,2010,108(4):1408-1420.

[37]Sánchez B,De Los Reyes-Gavilán C G,Margolles A.The F1F0-ATPase of Bifidobacterium animalis is involved in bile tolerance[J].Environmental microbiology,2006,8(10):1825-1833

[38]Ongol M P,Sawatari Y,Ebina Y,et al.Yoghurt fermented by Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus H+-ATPase-defective mutants exhibits enhanced viability of Bifidobacterium breve during storage[J].International Journal of Food Microbiology,2007,116(3):358-366

[39]An H,Zhou H,Huang Y,et al.High-level expression of hemedependent catalase gene katA from Lactobacillus sakei protects Lactobacillusrhamnosus from oxidative stress[J].Molecular biotechnology,2010,45(2):155-160

[40]Fu R Y,Bongers R S,Van Swam I I,et al.Introducing glutathione biosynthetic capability into Lactococcus lactis subsp.cremoris NZ9000 improves the oxidative-stress resistance of the host[J].Metabolic engineering,2006,8(6):662-671

[41]Tsai Y T,Cheng P C,Fan C K,et al.Time-dependent persistence of enhanced immune response by a potential probiotic strain Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NTU 101[J].International Journal of Food Microbiology,2008,128(2):219-225

[42]Vinderola G,Perdigon G,Duarte J,et al.Effects of kefir fractions on innate immunity[J].Immunobiology,2006,211(3):149-156