王金昌，郑国华，傅筱冲

(江西省科学院微生物研究所，江西 南昌330096)

化学肥料的长期低效施用，会造成土壤中某些矿质元素的过度积累和土壤理化性质的变化，而且会引起环境污染，影响人类健康。研究人员发现植物根际促生细菌(plant growth promoting rhizohacteria，PGPR)能够极大的减少这些化学肥料的利用。本实验分离筛选到一株能解钾又能解磷的路德维希肠杆菌，并对其促生性能进行试验。

1 材料与方法

1.1 培养基

钾细菌分离培养基:葡萄糖10.0 g，Na2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO4· 2H20 0.2 g，CaCO35.0 g，琼脂15.0 g，钾长石粉(200目)2.5 g，去离子水1 000 mL，pH 7.2。

有机磷培养基:葡萄糖10 g，NaCl 0.3 g，MgS04·7H2O 0.3 g，MnSO4·4H2O 0.03g，CaCO35 g，琼脂15～18 g，pH 7.0～7.5，(NH4)2SO40.5 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，酵母膏0.4 g，卵磷脂2 g，蒸馏水1 000 mL，121℃灭菌20 min。

1.2 样品采集

菜园土壤。

1.3 分离筛选方法

样品+无菌水，梯度稀释，涂布在钾细菌分离培养基平板上，28℃培养，挑取产生明显溶解圈的单菌落，纯化后保存。

1.4 上清液速效钾测定

准确称取0.5 g钾矿粉到95 mL解钾培养基(无钾)中，121℃灭菌20 min，待测菌悬液以5%的接种量接入摇瓶菌种，每个菌种做3个平行，同时设无接种对照37℃，160 rpm/min培养25 d，离心培养液，吸取4 mL离心上清液，利用火焰分光光度计法测钾。

1.5 平板检测分离到的细菌的解磷能力

用灭菌牙签挑取菌株的单菌落点植于有机磷平板上，将平板倒置于30℃恒温箱中培养5 d，观察菌落生长情况及透明圈产生情况。

1.6 有机磷液体培养中解磷能力测定

待测菌悬液以5%的接种量接种到有机磷液体培养基，置30℃，160 rpm/min振荡培养5 d后，离心取2 mL上清液，采用K2S2O4消解，磷钳蓝比色法测定上清液磷含量。

1.7 菌种鉴定

细菌16S rDNA鉴定:收集LB培养液中培养的菌体，采用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌的总DNA。利用16S rDNA通用引物进行PCR，PCR产物纯化后和pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌，提取重组质粒进行测序，得到16S rDNA部分序列。16S rDNA序列通过BLAST程序与GenBank中核酸数据进行序列分析和同源性比对。

1.8 空心菜盆栽施肥实验

当菜子发芽后长到5～6寸，6片小叶(自发不带土移栽菜秧20颗，分为2组。第1组加分离筛选到的活菌液2 mL/砵，第2组加死分离筛选到的死菌液(高压灭菌)2 mL/砵。每天早晚各浇1次水，第10 d施尿素浓度5 μg/mL，用量:100 mL/砵。第87 d收菜，洗掉泥土，晾干称重。

2 实验结果与分析

2.1 分离筛选结果

本实验分离筛选到一株能分解钾矿石的细菌K3，见图1。

图1 分解钾矿石的细菌K3菌落图

2.2 速效钾产生能力分析

将K3菌株以5%的接种量接入摇瓶菌种，每个菌种做3个平行，同时设无接种对照37℃，160 r/min培养25 d，离心培养液，吸取4 mL离心上清液，利用火焰分光光度计法测钾。结果接种培养液中速效钾增加百分比为36%。

2.3 分离细菌的解磷能力的检测结果

K3菌株能明显的产生溶磷圈，溶圈直径达到了8 mm，D/d值为4，见图2。

图2 K3菌株产生的溶磷圈图

2.4 K3菌株在有机磷液体培养基中解磷能力测定

用磷钳蓝比色法测定磷含量，K3菌株在原培养中磷含量为9.352 2 μg/mL，在有机磷液体培养基中培养后，上清液的含磷量为3.164 5 μg/mL，解磷率达66.2%，解磷能力显著。

2.5 菌种鉴定

收集LB培养液中培养的菌体，采用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌的总DNA。通用引物 7f(5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3')和1540r(5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')进行PCR，PCR程序设定为预变性94℃5 mim，94℃ 30 s，55℃ 35 s，72℃ 1 min，35个循环，延伸8 min，PCR产物结果见图3。PCR产物纯化后和pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌，提取重组质粒进行测序，测序得到16S rDNA部分序列，共 1 534 bp，提交 Gen-Bank，登录号为KF770841。将 K3菌株的16S rDNA序列通过BLAST程序与GenBank中核酸数据进行序列分析和同源性比对，该菌株序列与肠杆菌属中的路德维希肠杆菌同源性达97%。

2.6 空心菜盆栽施肥结果

空心菜盆栽施肥实验结果见表1。从表1可见，活菌液有明显的促进空心菜生长的能力。

图3 PCR扩增K3菌株16S rDNA产物图

表1 空心菜盆栽施肥实验结果

3 讨论

PGPR为植物提供N、P、K等肥料。土壤中的磷总量并不少，但土壤中95%以上的磷为无效形式，植物很难直接吸收利用。土壤中存在众多的微生物能将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态。具有这种能力的微生物称为解磷菌或溶磷菌(Phosphate solubilizing microorganisms，PSM)。Gulati等发现不动杆菌BIHB 723会分泌葡萄糖、草酸、2-酮基葡萄糖、乳酸、苹果酸和蚁酸来溶解磷酸三钙和岩石中的磷［1］。并且不动杆菌BIHB 723既能溶解无机磷又能溶解有机磷，拌种能促进豌豆、鹰嘴豆、玉米、大麦生长［2］。我国约有60%的耕地缺钾，耕地速效钾含量正以每年(2～3)×106的速度下降，造成土壤中氮、磷、钾3种元素比例失调，影响了农业的发展。利用化学钾肥补钾是我国农业中普遍使用并且见效较快的土壤速效钾补充方法，但造成了土壤结构破坏、有机质含量下降，且污染严重、成本高。解钾菌是从土壤中分离出的一种能分化铝硅酸盐和磷灰石类矿物的细菌，促进难溶性的钾、磷、硅、镁等养分元素转化成可溶性养分，增加土壤中速效养分的含量，能作为微生物肥料，促进作物生长发育，提高产量［3］。土壤芽孢杆菌NBT是钾释放菌株，在K－缺乏土壤盆栽试验研究发现它能促进棉花和葡萄生长，在棉花和葡萄土壤中添加难溶的K矿石粉，结果土壤钾含量增加了30%和26%，细菌接种也导致地上植物氮、磷的含量提高［4］。

本实验成功分离筛选到一株耐热的既能解钾又能解磷的路德维希肠杆菌，发现它也能促进空心菜的生长。龚凤娟等从杜仲中也分离到路德维希肠杆菌，发现它具有1-羧基-1-氨基环丙烷(1-aminocy-clopropane-1-carboxylate，ACC)脱氨酶活性，ACC脱氨酶能裂解乙烯前体ACC，从而降低植物激素乙烯的水平，进而抑制乙烯对植物的三重反应，促进植物根和茎伸长、生长，提高养分吸收和光捕获面积，增加植物干物质积累，而且扩增的根部组织能增强植物对根际微生物分泌或分解的促生物质和土壤养分的有效利用［5］。赵现伟等还发现路德维希肠杆菌具有联合固氮作用［6］。

本实验筛选到的路德维希肠杆菌，既能解钾又能解磷，可用于开发微生物肥料。

［1］ Arvind G，Vyas P，Sharma N，et al.Organic acid production and plant growth promotion as a function of phosphate solubilization by Acinetobacter rhizosphaerae strain BIHB 723 isolated from the cold deserts of the trans-Himalayas［J］.Achives of Microbiology，2010，192(11):975－983.

［2］ Arvind G，Vyas P，Rahi P，et al.Plant growth-Promoting and rhizosphere-competent acinetobacter rhizosphaerae strain BIHB 723 from the cold deserts of the himalayas［J］.Current Microbiology，2009，58(4):371－377.

［3］ 周毅峰，罗云霞，刘华中.解钾菌的筛选［J］.湖北民族学院学报(自然科学版)，2009，3(27):285－288.

［4］ Sheng X F.Growth promotion and increased potassium uptake of cotton and rape by a potassium releasing strain of Bacillus edaphicus［J］.Soil Biology and Biochemistry，2005，37(10):1918－1922.

［5］ 龚凤娟，恩特马克·布拉提白，张宇凤，等.具有ACC脱氨酶活性的杜仲内生细菌的分离鉴定及其抗菌活［J］.微生物学通报，2011，38(10):1526－1532.

［6］ 赵现伟，Chaudhary Hassan Japed，何玉梅，等.先锋牧草－香根草联合固氮菌多样性［J］.微生物学报，2009，49(11):1430－1437.