黎 明，马 超，李学如，杨思源

铁是生物体生命活动所必需的金属营养元素，几乎所有病原菌感染过程都需要铁[1]，宿主与病原菌之间对铁元素争夺是感染性疾病发生与发展的核心[2]。正常情况下，宿主体内存在的高铁结合常数(1036)和低铁饱和度(30%～40%)的铁结合蛋白，使体内环境中可利用铁的浓度几乎为零(10-18mol/L)，确保了机体自身免疫系统应对病原菌的攻击。病原菌为了从宿主体内获得可利用的铁，进化形成各种非常有效的铁吸收转运系统，从机体转铁蛋白、血红蛋白、肌红蛋白、血红素酶类等铁结合蛋白中夺取铁，以满足自身生长繁殖和感染的需要，并通过调控蛋白精确地调节铁的吸收，使病原菌体内铁离子浓度始终保持平衡[3]。一旦这种平衡被打破，就会导致病原体生命活动受阻甚至死亡，因此，干扰和阻断病原菌金属离子吸收转运与调节过程，有望成为筛选抗菌药物的新靶点，与之相关的一些蛋白被认为是重要的亚单位疫苗候选分子[4]。

猪链球菌2型(Streptococcussuistype2,SS2)菌株是猪链球菌中毒力最强、危害最严重、流行最广的人兽共患病病原体，我国江苏和四川部分地区曾在1998年和2005年暴发SS2感染大面积流行，导致上万头生猪死亡，上百人感染发病，几十人死亡，备受全球关注，SS2感染已成为公共卫生防疫重点[5-6]。近年来，在我国众多研究团队通力合作下，猪链球菌2型菌株毒力因子和致病机理研究方面取得了进展，但该菌生理生化、遗传特性、毒力和致病机理方面还有很多未解之谜，制约临床早期救治和预防性疫苗研制[7-8]。本文就与猪链球菌金属铁元素吸收及其机理相关研究进展作一介绍，以期为猪链球菌致病机理研究和预防性疫苗研制提供一定参考。

1 铁元素为猪链球菌生长繁殖所必需

最早关注铁对猪链球菌生长繁殖影响的是加拿大学者Niven等[9]，他们在培养基中添加Chelex-100和ethylenediamine di-o-hydroxyphenylacetic acid(EDDA)螯合剂，猪链球菌生长未受影响，于是他们提出，铁元素可能不是猪链球菌生长必需的营养因子。随后Winterhoff 等[10]在培养基中添加螯合能力更强的金属螯合剂nitrilotriacetic acid (NTA)，发现猪链球菌生长受到抑制，相关蛋白表达下调。Wei Li等[11]在培养基中添加100μmol/L对铁螯合作用更强的螯合剂Dipyridyl(DPD)，研究SS2中国分离株(四川分离株)在铁饥饿状态下基因表达状况，结果显示，与细菌代谢、遗传、细胞壁合成、转录复制、物质吸收转运、毒力等相关的63个基因表达发生变化，证实了铁元素与猪链球菌生长繁殖和毒力因子表达相关。本课题组近期研究发现，在THYB培养基中添加足够量DPD，几乎完全抑制SS2中国分离株(四川分离株)的生长，在含DPD的培养基中添加2价或3价无机铁离子，细菌的生长得以完全恢复，特别值得关注的是，在含DPD的培养基中添加血红蛋白，菌株生长繁殖更好，这一研究结果与病原菌更喜欢血红蛋白铁的结论一致[12]，因此，推测SS2中国分离株(四川分离株)可能像化脓性链球菌等引起严重感染性疾病的病原菌一样，存在利用宿主血红蛋白铁的吸收系统。

2 猪链球菌铁吸收转运系统

细菌生命活动必需金属营养元素Fe、Mn、Zn等离子吸收通常是通过ABC(ATP-bindingcassette proteins)转运系统来完成的，典型的ABC金属离子转运操纵子除ATP结合蛋白(ATPase)和疏水性的膜通透蛋白(Permease)外，还有1个重要的金属离子绑定蛋白 (binding protein)，整个操纵子由3到4个基因编码，图1为革兰阴性(A)和革兰阳性(B)细菌ABC操纵子金属离子吸收转运示意图。敲除其中任何一个基因或者灭活其中任何一个蛋白，该转运操纵子就会失去其生物学功能，导致病原菌毒力下降，生命活动受阻，甚至死亡[13-14]。

图1 革兰阴性(A)和革兰阳性(B)细菌ABC操纵子金属离子吸收转运示意图[14]

与其他链球菌相比较，猪链球菌铁吸收转运相关研究报道十分有限。根据目前报道的其他链球菌铁吸收相关研究结果，与我国科研工作者2007年完成全基因组序列测定和组功能注释的猪链球菌05ZYH33菌株进行生物信息分析发现，猪链球菌至少存在一个3价铁吸收相关操纵子Fhu，一个2价铁吸收相关操纵子Feo，一个与铁和其他金属离子吸收转运相关的Mut操纵子以及一个与金属铁、锰、锌等吸收有关的Mts操纵子，这些操纵子的功能受金属吸收调节基因fur和金属依赖转录调节基因mtsR调控(图2)。4个操纵子的金属离子绑定蛋白在NCBI数据库猪链球菌05ZYH33全基因组序列中，基因位点识别号分别为SSU05-0649、SSU05-1409、SSU05-1771和SSU05-2086，将它们依次命名为fhuA、feoA、mutA和mtsA。Wei Li等[11]研究发现，SS2菌株在限铁状态下，所涉及与细菌代谢、遗传、细胞壁、转录复制、物质吸收转运、毒力等相关的表达发生改变的63个基因中，3价铁吸收相关操纵子Fhu金属离子绑定fhuA基因表达上调6倍以上，Mut操纵子mutA基因表达上调4倍以上，而2价铁吸收相关操纵子Feo的feoA基因表达下调一倍左右。这一结果证实SS2菌株铁吸收操纵子的存在。Aranda[15]等研究发现，与其他致病菌不同，猪链球菌二价金属铁离子吸收转运系统Feo在感染性疾病发生过程中起着重要作用，敲除金属离子绑定表面蛋白feoA基因，突变株毒力下降，免疫分析显示，FeoA蛋白为猪链球菌的重要毒力因子和分子疫苗的竞争者。从目前有限研究结果来看，猪链球菌金属离子吸收与细菌毒力相关，因此，进一步深入研究猪链球菌金属离子吸收调控与细菌毒力关系，对于揭示猪链球菌致病机理和寻找预防性疫苗分子具有积极意义。

图2生物信息分析猪链球菌05ZYH33金属铁离子吸收转运操纵子和调节基因

Fig.2AnalysisofmetalironionuptaketransporteroperonsandtheregulationgenesbybioinformaticsmethodsinStreptococcussuis05ZYH33

3 猪链球菌金属离子吸收转运调节蛋白与疫苗分子

细菌金属离子在体内的平衡由金属吸收调节蛋白Fur和/或金属依赖调节蛋白DtxR超家族成员所调控，它们不仅在细菌金属元素的吸收转运和氧化应激方面扮演重要角色，同时控制病原菌多个重要毒力因子的表达，尽管Fur和DtxR调控蛋白的结构和DNA结合位点完全不同，但都是以二聚体形式通过其翼状螺旋基序绑定到所调控基因的启动子或临近启动子的DNA上从而抑制该基因表达[16]。在猪链球菌中，金属吸收调节蛋白和金属依赖调节蛋白是如何调节铁元素吸收还不十分清楚，有关这方面的研究主要集中在Fur超家族成员Fur或Zur在调控细菌毒力功能和免疫方面。大量研究结果显示，金属吸收调节蛋白Fur不仅调控细菌金属元素吸收转运，而且还调控病原菌多个重要毒力因子的表达，与病原菌引起的严重性感染有关，具有很强的免疫活性[17-21]。DtxR超家族成员金属依赖调节蛋白MstR对猪链球调控功能，目前我们还不了解，生物信息分析显示，猪链球菌MtsR蛋白含219个氨基酸残基，N端为DNA绑定结构域，C端是金属依赖抑制或2价铁转运FoeA结构域，连接两端的是金属离子绑定结构域(图3-A)。理论分析可以看出，猪链球菌MtsR的结构决定了MtsR应该具有多重调节功能。在化脓性链球菌中，MtsR调控包括金属离子尤其是血红蛋白铁吸收、毒力基因和代谢途径等在内的64个基因表达，特别是MtsR对GAS重要致病调控子Mga和M蛋白、Ska等毒力因子具有很强激活作用，与重症链球菌感染相关[16]。同源性分析表明，SS2和GAS的MtsR两者之间的Identities=128/212(61%), Positives=162/212(77%) (图3-B)，因此，有理由推测SS2的MtsR也可能具有化脓性链球菌MtsR类似功能，与SS2致病性相关。

图3 猪链球菌MtsR蛋白结构示意图(A)及其与化脓性链球MtsR蛋白同源性分析(B)

Fig.3DiagramofStreptococcussuisMtsRproteinstructure(A)anditshomologytoStreptococcuspyogenesMtsRprotein(B)

综上所述，宿主与病原菌之间对铁元素争夺结果决定感染性疾病发生与发展，早期研究认为，铁元素对猪链球菌生长繁殖影响不大，使得对猪链球菌铁吸收与调控相关知识了解甚少。近期研究结果证实，与其他病原菌一样，铁元素不仅影响猪链球菌生长繁殖，还与猪链球菌毒力相关。生物信息分析显示，猪链球菌中国分离株05ZYH33可能存在4个与铁离子吸收转运相关操纵子以及金属吸收调节基因fur和金属依赖转录调节基因mtsR。那么这4个操纵子是否都具有吸收铁元素的功能？金属吸收调节蛋白和金属依赖调节蛋白调节猪链球菌铁元素吸收机理如何？猪链球菌铁吸收与调控是如何调节毒力因子表达的？它与一直困扰我国科学家的猪链球菌中国分离株引起严重侵袭性感染如中毒休克综合征(Streptococcal toxic shock syndrome STSS)的发生与发展有无关系？这些迷惑我们的问题都有待于进行深入细致的研究加以解决。目前已有资料表明，病原菌更喜欢血红蛋白铁，一些引起严重感染性疾病的革兰阳性菌如化脓性链球菌、肺炎链球菌、金色葡萄球菌、炭蛆杆菌都具有利用血红蛋白生长繁殖的特性，血红蛋白铁吸收系统的存在与菌株的致病性有强烈的相关性[1,13,21-22]。猪链球菌在含DPD的培养基中添加血红蛋白，菌株生长繁殖更好，生物信息分析表明，猪链球菌中没有化脓性链球菌、肺炎链球菌、金色葡萄球菌、炭疽杆菌等病原菌同源的血红素铁吸收操纵子，那么猪链球菌是怎样吸收转运血红素铁的呢？Zou等[24]最近的研究结果表明，海豚链球菌的Mts操纵子的金属离子绑定蛋白MtsA具有绑定血红蛋白功能，也许猪链球菌也是通过Mts操纵子来完成的。

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