陶成凤

(昆明市南屏口腔医院修复科，云南 昆明 650041)

牙周组织再生动物模型的研究进展

陶成凤

(昆明市南屏口腔医院修复科，云南 昆明 650041)

牙周炎是以造成牙周组织破坏为特点的口腔疾病，牙周膜是口腔牙周组织重要的组成部分，牙周组织的丧失是成年人失牙的主要原因，如何有效地终止病变并再生牙周组织在将来有可能会成为牙周炎新的治疗方法之一。牙周组织的再生研究中，动物模型起到了非常重要的作用，本文对牙周组织再生研究中使用的动物及其特点做一综述。

牙周组织再生；动物模型；牙周炎；牙周膜

牙周炎是一种由微生物导致的炎症，以牙周支持组织破坏丧失为特征的口腔疾病[1]，有将近51%的成年人随着年龄增长，因牙周炎而导致失牙，是造成成年人失牙的主要原因[2]。牙周膜（PDL）是牙周组织结构的一部分，是连接牙齿和牙槽窝的软组织，具有稳固牙齿、咀嚼时提供支持和缓冲保护、传导感受等作用[3]，是牙周组织中不可替代的组成部分。大多数情况下被破坏的牙周支持组织难以恢复，即使牙周病变终止，牙周支持组织的恢复能力也很有限[4]。目前，以组织工程学方法有效地再生恢复被破坏的牙周支持组织是研究的热点之一。在再生牙周组织的研究中，建立牙周组织再生动物模型对研究有重要的作用和意义，本文就牙周组织再生研究中使用的动物模型及其特点做一综述。

1 牙周组织再生实验动物模型的建立

1.1 Beagle犬牙周组织再生动物模型Beagle犬属于哺乳动物，又称为猎兔犬，性情温顺，易于管理饲养。Beagle犬的牙周组织生理结构，流行病学和组织病理学和人类都很相似。早在20世纪70～80年代就被用于牙周病的实验研究[5-6]。Iwata等[7]采用犬牙周膜来源的细胞进行培养，将培养后的牙周膜细胞制成细胞膜片。将犬前磨牙拔除后5周，在犬第一磨牙近中制备出深5 mm×5 mm×4 mm（深，近远中，颊舌向距离）窝洞，同时刮除第一磨牙近中根中1/3的牙骨质，在刮除了牙骨质表面的根面覆盖三层制备好的细胞膜片，再于细胞膜片表面覆以聚羟基乙酸膜，以β-三磷酸钙填充窝洞剩余部分，将牙龈缝合复位，对照组只放置聚羟基乙酸膜，不放置细胞膜片。6周后处死Beagle犬，取相应部位组织进行检测对比。结果发现未放置膜片的对照组中牙槽骨恢复至原有水平的一半，而放置了细胞膜片的实验组，不仅牙槽骨恢复形成新的牙槽脊，还可通过微型CT三维重观察到与牙周膜纤维连接良好的牙骨质形成，Azan染色显示在新形成的牙骨质和牙槽骨之间有韧带样组织的形成，在偏振光下进一步确认了牙周韧带标志性的胶原纤维的存在。在“种植体修复缺失牙：组织工程学方法建立牙周韧带”的研究中，将经过培养的Beagle犬牙周膜细胞种植于制成圆柱形生物性钛片表面(15 mm长，直径5～7 mm)，使植体表面被牙周膜来源地细胞覆盖，形成“牙周膜种植体(Ligaplant)”，将此种植体植入近中骨壁缺损的Beagle犬缺失牙区域，种植完成后以活动牙周夹板予以固定55～73 d后，获取组织样本，Masson三色染色后可观察到植体和牙槽骨之间存在垂直于植体和牙槽骨的牙周膜样组织，植体为紧密的胶原纤维所覆盖[8]。Beagle犬来源较广，体型适中，加上与人类相似的牙周组织结构，是建立牙周组织再生模型较理想的动物。

1.2 猴牙周组织再生动物模型猴属于非人灵长类，其生理结构及遗传在许多方面与人类极其相似。大多数非人灵长类的牙体及牙周组织结构与人类高度近似，除了在牙体体积大小上差异较为明显[9]。在“釉质基质蛋白不同成分对猴颊侧牙槽骨缺损模型上对牙周再生的影响研究”中，3～4岁龄的食蟹猴上颌从尖牙到第一磨牙颊侧翻粘骨膜瓣，除去暴露的牙骨质和牙周膜组织。从6个月龄小型猪的未萌出前磨牙和磨牙上用器械刮取釉质基质，取得釉质基质加入赋形剂制作成釉质基质制剂，将此釉质基质制剂覆于暴露的颊侧根面表面，将黏骨膜瓣复位至术前水平，缝合。8周后通过光镜和组织形态学方法下观察术区牙周组织，观察发现在术区根面使用了釉质基质的前磨牙在8周后超过一半的被破坏牙周组织得到恢复，使用了釉质基质酸性提取物的前磨牙术区8周后，牙周组织再生恢复明显，但是伴有轻度的牙龈退缩[10]。猴虽然是很多实验研究中理想的实验动物，但是猴属于自然保护动物，加上伦理方面的限制，价格昂贵，想要用猴作为实验动物模型进行大规模实验较为困难。

1.3 鼠牙周组织再生动物模型鼠繁殖能力强，来源广泛，价格适中，用于实验用途的鼠种类较多，可供选择的范围较广。目前，对鼠牙齿皮下移植后牙周组织再生情况的研究较多。Kawasaki等[11]对4周龄大小的Wistar大鼠双侧上颌第一和第二磨牙拔除后立即接种到大鼠腹部软组织，或者将拔除的牙齿用液氮冷冻过夜后再进行移植，研究冷冻对于牙齿再植后牙周组织再生的影响；Hosoya等[12]植GFP转基因大鼠的磨牙到野生型大鼠的皮下组织中，移植后5 d，HE染色观察发现移植牙被含有丰富血管的连接组织围绕，10 d后发现骨样组织形成于根分叉的分支部位，20 d后骨样组织几乎延伸充满整个根分叉部分；有学者等也进行了类似的研究，将大鼠上颌第一、二磨牙拔出后自体移植，与1、2、4、10周分别观察牙周组织再生和炎症，牙骨质再生和形成和牙槽骨的形成[13]。在上述3项研究中，通过不同的检测观察手段发现，在移植一定时间后，均发现移植牙体周围有新的硬组织形成，并且与牙体表面牙骨质之间有新的或者类似牙周膜的软组织形成，形成新的牙周组织结构。虽然鼠牙齿体积较小，对于实验操作有一定的要求，但是由于来源广泛，繁殖力强，价格适中，可以进行扩大规模的实验研究，应用于牙周组织再生研究中。

1.4 小型猪牙周组织再生动物模型小型猪在我国种类众多，如滇南小耳猪、巴马香猪、五指山猪和西藏小型猪荷包猪等。小型猪由于饲养成本低，体型较小，便于操作，而且小型猪由于在生理学，病理学、免疫学和解剖结构方面与人相似[14]，是研究一些人类疾病理想的动物模型。在“干细胞介导的牙周再生组织”的研究中，研究人员采用自体同源的牙周膜干细胞(从拔出的小型猪牙齿上取得，体外培养)，用手术去除牙槽骨+丝线结扎的方法造成牙周炎，将培养的牙周膜干细胞接种于手术造成的牙周炎缺损部位。实验总共14只小型猪，12只用于实验，2只不做任何处理，实验结束后处死，其牙周组织作为正常牙周组织对照。12只猪选择第一磨牙作为实验对象，于第一磨牙近中造成7 mm×3 mm×5 mm(长×宽×高)，共计48个缺损，模型建立后随机分为三组。治疗组治疗12周后影像学显示牙槽骨水平恢复明显，接近术前水平，牙周探诊深度减小，附着丧失程度较阴性对照组明显减轻，虽然经治疗后仍然存在轻度的牙龈退缩，但是干细胞治疗再生牙周组织仍然起到了相当的疗效[15]；Fawzy等[16]进行了与上述研究类似的牙龈缘来源的干细胞介导的牙周组织再生的实验研究，其实验动物也是小型猪。实验在小型猪第四前磨牙，第一、二磨牙近中造成缺损，以牛松质骨和胶原蛋白作为载体，将干细胞接种到缺损区域，12周后观察发现，以牛松质骨作为载体的实验组牙周袋深度变化和临床附着丧失水平等各向指标较治疗前均有明显好转，但是一样存在轻度的牙龈退缩。

在人体中具有多种干细胞存在，存在于多种组织当中，如骨髓、滑膜、骨膜、骨骼肌、脂肪组织等[17]。通过干细胞介导的治疗方法在小型猪动物模型上进行的探索为将来牙周炎新疗法的产生提供了一个重要的发展方向。

2 实验动物的选择

实验动物的选择需要根据实验的目的来确定，同时也需要考虑实验室的条件情况，如动物饲养环境或者标准动物饲养等。一般来说，如果是考察食物，细菌或者其他因素对牙周炎症的影响，使用一些小型的动物即可满足要求，如大鼠和豚鼠；如果是生物活性材料和新疗法安全性的最后确认，则需要较大的实验动物，如猴和犬，但是在使用猴和犬作为实验动物的时候，必须要通过伦理审查[18]，方能进行实验。

在选择实验动物时，一方面，选择其生理特点和病理变化与人相近者为佳，另外一方面，要求实验动物容易获得，便于管理，成本合理。一般而言，实验动物等级越高，其代谢、结构和病理变化等与人类就越接近。目前生理和遗传与人类最接近的是非人灵长类动物(黑猩猩、猴子、狒狒等)，与人类在众多方面相似度极高。选择合适的实验动物，对实验的顺利进行和实验预期目标的达成有重要的意义。

3 总结

牙周膜在牙周组织中起着非常重要的作用，牙周膜的破坏丧失往往意味着牙齿的松动，并伴有不同程度的不适和功能下降，牙周膜破越严重，牙齿保留的希望就越小。有调查研究显示，随着年龄的增长，因为牙周问题而失牙的比例呈增加趋势[19]。如何有效地终止牙周病变并恢复牙周膜和其周围牙周组织一直是一个重要的研究课题。

动物模型在牙周组织再生实验研究中一直占有重要的地位，对牙周炎的治疗研究起到了不可替代的作用。有各种种属不同的动物被用于牙周炎的实验研究，如猴，犬、鼠、兔、羊[18]和小型猪等，目前对这些动物的牙周组织再生研究都取得了一定的成果。然而，想要将现阶段取得的成果转化为真正可以应用于临床的治疗手段还有很多问题有待解决，不停地探索和研究将会为未来牙周疾病的治疗产生出新的更有效的治疗手段。

[1]Hajishengallis G,Lambris JD.Complement-targeted therapeutics in periodontitis[M].ComplementTherapeutics.Springer,2013: 197-206.

[2]Phipps KR,Stevens VJ.Relative contribution of caries and periodontal disease in adult tooth loss for an HMO dental population [J].Journal of Public Health Dentistry,1995,55(4):250-252.

[3]Beertsen W,Mcculloch CA,Sodek J.The periodontal ligament:a unique,multifunctional connective tissue[J].Periodontology 2000, 1997,13(1):20-40.

[4]Bartold PM,Shi S,Gronthos S.Stem cells and periodontal regeneration[J].Periodontology 2000,2006,40(1):164-172.

[5]Sorensen WP,LE H,Ramfjord SP.Periodontal disease in the beagle dog A cross sectional clinical study[J].Journal of Periodontal Research,1980,15(4):380-389.

[6]Lindhe J,Berglundh T,Ericsson I,et al.Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues.A study in the beagle dog[J]. Clinical Oral Implants Research,1992,3(1):9-16.

[7]Iwata T,Yamato M,Tsuchika H,et al.Periodontal regeneration with multi-layered periodontal ligament-derived cell sheets in a canine model[J].Biomaterials,2009,30(14):2716-2723.

[8]Gault P,Black A,Romette JL,et al.Tissue-engineered ligament:implant constructs for tooth replacement[J].Journal of Clinical Periodontology,2010,37(8):750-758.

[9]Chandna S,Hegde S,Bathla M.Animal models in Periodontology: a review[J].Journal of Oral Health Research,2011,2(2):165-166.

[10]Hammarstr ML,Heijl L,Gestrelius S.Periodontal regeneration in a buccal dehiscence model in monkeys after application of enamel matrix proteins[J].Journal of Clinical Periodontology,1997,24(9 Pt 2):669.

[11]Kawasaki N,Hamamoto Y,Nakajima T,et al.Periodontal regeneration of transplanted rat molars after cryopreservation[J].Archives of Oral Biology,2004,49(1):59-69.

[12]Hosoya A,Ninomiya T,Hiraga T,et al.Alveolar bone regeneration of subcutaneously transplanted rat molar[J].Bone,2008,42(2): 350-357.

[13]Staels S,De Coster P,Vral A,et al.An experimental study on periodontal regeneration after subcutaneous transplantation of rat molar with and without cryopreservation:an in vivo study[J].Cryobiology,2013,66(3):303-310.

[14]Wang S,Liu Y,Fang D,et al.The miniature pig:a useful large animal model for dental and orofacial research[J].Oral Diseases, 2007,13(6):530-537.

[15]Liu Y,Zheng Y,Ding G,et al.Periodontal ligament stem cell-mediated treatment for periodontitis in miniature swine[J].Stem Cells, 2008,26(4):1065-1073.

[16]Fawzy El-Sayed KM,Paris S,Becker ST,et al.Periodontal regeneration employing gingival margin-derived stem/progenitor cells: an animal study[J].Journal of Clinical Periodontology,2012,39 (9):861-870.

[17]Shirasawa S,Sekiya I,Sakaguchi Y,et al.Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues:superiority of synovium as a cell source[J].Arthritis&Rheumatism,2005,52(8): 2521-2529.

[18]Struillou X,Boutigny H,Soueidan A,et al.Experimental animal models in periodontology:a review[J].The Open Dentistry Journal,2010,4(37)258-259.

[19]Oliver RC,Brown LJ.Periodontal diseases and tooth loss[J].Periodontology 2000,1993,2(1):117-127.

Animal models in periodontal tissue regeneration.

TAO Cheng-feng.
Nanping Stomatology Hospital of Kunming,

Kunming 650041,Yunnan,CHINA

Periodontitis is an oral disease that causes destruction of the periodontal tissue,periodontal ligament is an important part of the periodontal tissue,the loss of periodontal tissue is the main cause of adult tooth loss, and how to terminate the lesions and regenerate the periodontal tissue is likely to be one of the new treatments for periodontitis.Animal model counts for much in the periodontal regeneration research,a review about animal model in the periodontal regeneration research and their characteristics will be present here.

Periodontal regeneration;Animal models;Periodontitis;Peridontal ligament

R781.4

A

1003—6350（2014）08—1166—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.08.0451

2013-10-25)

陶成凤。E-mail：wrd5501@163.com