布冠好，朱婷伟，陈复生，张 楠，刘昆仑，张丽芬

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

0 引言

大豆和大豆副产品因为其较高的营养价值和良好的物理化学性质，被广泛应用于食品和饲料工业中.然而，大豆蛋白长期以来也被认为是食物过敏原之一.此外，由于大豆蛋白过敏原可能在幼龄动物及人体内引起潜在的过敏反应，随着大豆蛋白产品在食品工业中使用量的增加，大豆蛋白致敏性的研究也越来越多[1].在大豆中，至少检测到21 种致敏蛋白，大豆球蛋白（Glycinin）是其中之一，它已被确定为主要的大豆变应原[2].大豆球蛋白是由酸性（A1a、A1b、A2、A3、A4、A5）和碱性（B1a、B1b、B2、B3、B4）多肽链通过二硫键连接组成，其中每条酸性链和碱性链的分子质量分别为34～44 ku和20 ku[3]，它为11S 的主要成分，占总大豆蛋白的19.5%～23.1%，分子质量为300～380 ku[4].据报道，大豆球蛋白过敏反应会产生腹泻、肠道损害、免疫功能紊乱等现象[5]，而免疫反应的严重程度取决于大豆球蛋白的剂量.

过敏原在食物制品中的检测是非常困难的，因为变应原通常是很微量的，且可以由食物基质屏蔽[1].大豆球蛋白的定量测定可以通过高效液相色谱法进行[4]，但该方法耗时，且需要昂贵的设备.免疫分析方法因其操作简单、廉价、处理样品量大等优点已经被广泛应用.其中，酶免疫法（ELISA）现已应用于牛乳蛋白、大豆蛋白的快速检测分析中[6].布冠好等[7]已建立了测定牛乳球蛋白的间接竞争ELISA 方法.Liu 等[8]建立了竞争ELISA 方法来检测大豆中β-伴大豆球蛋白的α 亚基，得到的方法灵敏度较高.Cucu 等[9]基于竞争ELISA 法来测定食物中大豆过敏原蛋白.本研究意在建立一种间接竞争ELISA 法用于检测大豆中主要过敏原大豆球蛋白，为低敏性大豆制品的开发提供检测方法.

1 材料与方法

1.1 试验材料

大豆球蛋白（Glycinin，G3171），β-conglycinin（C5868），酶标二抗（HRP 标记的羊抗兔IgG，A6154），弗氏完全佐剂和弗式不完全佐剂：Sigma公司；新西兰大白兔：郑州大学实验动物中心提供；兔抗Glycinin 血清（自制）；牛血清蛋白（BSA），TMB 单组份显色液：北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均为分析纯.

1.2 仪器与设备

96 孔酶标板：Corning Costar 公司；FC 型酶标仪：赛默飞世尔仪器有限公司；LRH-150F 型恒温生化培养箱：上海一恒科技有限公司.

1.3 试验方法

1.3.1 兔抗大豆球蛋白多克隆抗体的制备[10]

选取2 只成年健康雄性新西兰大白兔，平均体质量2.5 kg，随机编号，饲养于郑州大学实验动物中心.喂养3 d 后，观察无异样，即进行免疫处理.将免疫抗原大豆球蛋白（Glycinin）分别用无菌去离子水稀释至浓度为1 mg/mL，分装，-20 ℃保存；第1 次免疫前耳缘静脉采血，收集阴性对照血清；免疫时每次取合适剂量的抗原用无菌去离子水稀释至600 μL，再与等体积的弗氏完全或不完全佐剂充分乳化后，颈背部皮下多点注射成年雄性家兔，免疫6 次.第1 次取抗原300 μL 与等量弗氏完全佐剂充分乳化后，颈背部皮下多点注射；第2～5 次，每隔10 d 进行一次免疫，每次取200 μL 抗原与等量弗氏不完全佐剂充分乳化后，颈背部皮下多点注射；最后一次不含佐剂加倍的抗原耳缘静脉注射，3 d 后心脏采血，收集血清、分装后-20 ℃保存.5 免后第7 天耳缘静脉采血，分离血清，由间接ELISA 方法检测多抗血清效价.然后第6 次免疫，3 d 后大量采血，先于37 ℃放置1 h，然后于4 ℃放置过夜，使血清充分析出，以3 000 r/min 离心10 min，分离血清，用小管分装后于-20℃保存.

1.3.2 间接竞争ELISA 方法的建立

1.3.2.1 间接ELISA程序[7]

包被抗原：以一定质量浓度的抗原包被96 孔酶标板，每孔100 μL，4 ℃过夜.次日倾去孔内液体，PBST（pH 7.4，0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液，0.05%Tween-20）洗涤4 次，每孔250 μL，每次3 min，然后用吸水纸拍干，用封闭液（pH 7.4，0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液，1% BSA，0.1% Tween-20）进行封闭，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h；之后，PBST 洗涤4次，拍干.抗原抗体反应：加入系列稀释的被测抗原和一定稀释度的抗血清1∶1 进行预混合，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，PBST 洗涤4 次，拍干；加入一定稀释度的酶标二抗，37 ℃孵育1 h，PBST 洗涤4 次，拍干；加入TMB 单组分显色液，每孔100 μL，37 ℃显色10 min 后，每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4终止反应.利用酶标仪双波长测定各孔的OD 值，实际OD 值=OD450-OD620.

1.3.2.2 抗血清工作浓度和抗原最佳包被浓度的确定

利用方阵滴定法，将抗原Glycinin 用包被液（pH 9.6，50 mmol/L 碳酸盐缓冲液）稀释为0.1、0.05、0.025、0.012 5 μg/mL，每行一个稀释度加入到酶标板中，4 ℃过夜.抗血清用封闭液稀释成1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200，每列一个稀释度加入到酶标板中，37 ℃孵育1 h.然后按照1.3.2.1 的步骤进行OD 值的测定，选择OD 值在1.0 左右的抗原和抗血清浓度为最佳工作浓度.

1.3.2.3 酶标二抗稀释度的选择

在优化出的最佳抗原包被浓度和最佳抗血清稀释度下，将酶标二抗用封闭液稀释为1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000，每行一个稀释度，每孔100 μL，分别加入到酶标孔中.然后按照1.3.2.1 的步骤进行OD 值的测定，选择OD 值在

1.0 左右的酶标二抗浓度为最佳工作浓度.

1.3.2.4 抗原最佳包被时间的确定

以最佳的抗原包被浓度包被酶标板，分别在4℃过夜，37 ℃孵育2 h 后4 ℃过夜，37 ℃孵育2 h，37 ℃孵育4 h 条件下放置，抗血清和酶标二抗浓度均为最佳工作浓度，然后按照1.3.2.1 的步骤进行OD 值的测定，确定最佳的抗原包被时间.

1.3.2.5 抗原抗体最佳反应条件的选择

用最佳抗原浓度和最适包被条件来包被酶标板，并选择最佳的抗血清和酶标二抗稀释度加入，抗原抗体分别在37 ℃和25 ℃下反应0.5、1、2 h，测定OD 值来确定最佳的抗原抗体反应条件.

1.3.2.6 底物最佳反应条件的确定

在其他条件为最佳条件的情况下，底物显色反应分别在37 ℃温育5、10、20 min 及25 ℃温育5、10、20 min 进行，然后按照1.3.2.1 步骤，测定各组OD 值以确定最佳底物反应条件.

1.3.2.7 标准曲线的建立

将Glycinin 用包被液分别稀释成0.001～0.1 μg/mL 的浓度系列，在上述步骤得到的最佳条件下，进行间接竞争ELISA 测定.最后将Glycinin 各浓度对应的OD 值转换成（B/B0）%值为纵坐标，并以对应的Glycinin 浓度的常用对数值为横坐标，制作标准曲线.其中，B 为Glycinin 竞争时各对应浓度的OD 测量值，B0为无抑制时的OD 值.

选择标准曲线上呈明显相关区段的（B/B0）%和lg[Glycinin]，根据公式Logit（（B/B0）%）=ln（B/（B0-B）），计算各标准点的Logit（（B/B0）%），最后做对应于lg[Glycinin]的Logit（（B/B0）%）的回归分析，得出线性回归方程及相关系数.

1.3.2.8 方法的精密度

对建立ELISA 检测方法进行精密度测试，分别以板内变异系数和板间变异系数表示.板内误差：每一个样品浓度做4 次重复，计算标准差，以板内变异系数（CV）表示板内误差.板间误差：在不同的酶标板上分别做3 次重复，测定OD 值，计算出各浓度的标准差及变异系数，以板间变异系数表示板间误差.

1.3.2.9 抗体特异性鉴定[11]

将兔抗Glycinin 抗体与大豆蛋白中的伴大豆球蛋白（β-conglycinin）进行免疫交叉试验.

2 结果与讨论

2.1 抗血清效价的测定

在免疫过程中对兔子进行定期采血，对抗血清的效价进行检测，并对抗体特异性进行考察，以此为依据选择较好的抗体进行下一步的试验.由ELISA 方法测定兔抗Glycinin 血清的最高效价均达到了1∶10 000，所制备的抗血清效价较高[12]，可用于下一步的酶联免疫试验.

2.2 间接竞争ELISA 最佳条件的确定

2.2.1 抗血清最佳稀释度和抗原最佳包被浓度

建立ELISA 方法时，应对包被抗原及抗体的浓度进行优化，以达到最适合的测定条件，并且节省测定的费用.采用方阵滴定法来确定抗原最适包被浓度和抗血清最佳稀释度，结果如表1 所示.

表1 Glycinin 包被抗原和抗血清工作浓度的确定

当包被抗原Glycinin 的最佳包被浓度为0.025 μg/mL、对应的抗血清最适稀释倍数为1∶3 200 时，测定的OD 值在1.0 左右，说明Glycinin 抗原、抗体最佳工作条件分别为0.025 μg/mL 和1∶3 200.

2.2.2 酶标二抗最适工作浓度

在ELISA 方法中，酶标记物浓度的变化会对试验结果产生很大的影响.浓度过高，可使非特异性反应增加，浓度过低又影响测定结果的敏感性[12].试验中将HRP-羊抗兔IgG 做不同的稀释度，结果如表2 所示.

表2 HRP-羊抗兔IgG 最适工作浓度的确定

从表2 可以看出，随着稀释度的增大，OD 值逐渐减小；当酶标二抗以1:10 000 稀释时，测定的OD 值接近1.0，为酶标二抗的最佳工作稀释度.

2.2.3 抗原最适包被条件

将抗原固相化的过程称为包被.试验中，在不同条件下包被抗原结果如表3 所示.

表3 抗原包被条件的确定

由表3 可知，37 ℃包被2 h、4 h 及37 ℃温育2 h 过夜所测得的OD 值结果偏小，且所需时间较长；而4 ℃过夜包被抗原条件下所测得的OD 值在1.0 左右，为本试验得到的抗原包被的最佳条件.

2.2.4 抗原抗体最佳竞争反应条件

抗原抗体进行结合需要一定的时间和温度，此时反应的时间应严格控制.保温容器最好可使温度迅速平衡[13].本试验采用恒温箱，将酶标板置于底部垫有纱布的带盖金属湿盒中，放于恒温箱中进行反应.不同温度不同时间下抗原抗体反应测定结果见表4.

表4 抗原抗体反应温度和时间确定

从表4 可以看出，抗原抗体反应的最佳条件为37 ℃、1 h，此时，测定的OD 值接近1.0.

2.2.5 底物最佳反应条件

在ELISA 方法中，辣根过氧化物（HRP）为最常用的酶，它具有价格低廉和性质比较稳定的特点.本试验采用TMB 作为HRP 的底物，TMB 经HRP 作用后产物显蓝色，从而探究底物反应条件对显色反应的影响，结果见表5.

表5 底物反应温度和时间的确定

由表5 可知，在一定的温度下随着反应时间的增加，OD 值逐渐增大，在37 ℃温育10 min 时OD 值在1.0 左右，37 ℃反应10 min 之前，OD 值偏小，说明显色不完全.25 ℃下反应测得的OD 值均偏小.综合考虑选择37 ℃反应10 min 作为底物的最佳反应条件.

2.2.6 标准曲线的制作

将Glycinin 标 准 品 按0.001、0.01、0.012 5、0.015、0.02、0.025、0.03、0.04、0.05、0.1 μg/mL 稀释，在确定的大豆蛋白Glycinin 间接竞争ELISA 最佳试验条件下进行测定，以Glycinin 浓度的常用对数为横坐标，以抑制率（B/B0）%为纵坐标绘制得到标准曲线如图1 所示.

图1 Glycinin 间接竞争ELISA 法的标准曲线

由图1 可以得出，在0.01～0.05 μg/mL 范围内，标准曲线线性关系良好且曲线斜率也较大，故选取该区域进行回归直线方程拟合.线性回归转换后的回归分析结果见图2.

图2 Logit 回归的线性拟合曲线

在图2 中，回归方程中y 为Logit（（B/B0）%），x 为lg[Glycinin]，拟合的线性回归直线方程为y=-2.433 7x-4.677 7，相关系数R2=0.991 1，符合线性关系的判定标准.故最佳检测范围为0.01～0.05 μg/mL.

2.2.7 方法的精密度

Glycinin 间接竞争ELISA 精密度的测定结果如表6 所示.

表6 间接竞争ELISA 标准曲线的板内误差和板间误差

板内误差以标准曲线的板内平均变异系数（CV）来表示，其中，CV=SD 均值/平均孔间结合率×100%=1.46/38.24×100%=3.82%.

板间误差以3 次测定平均的板间变异系数（CV）表示，由表6 可得，各浓度的板间变异系数在6.31%～12.52%，平均为10.22%.ELISA 方法板内变异系数一般要求要低于10%，板间变异系数的允许值一般要求低于15%[12]，故由板内误差和板间误差可知，本试验方法重复性较好.

2.2.8 交叉反应

兔抗Glycinin 抗体的特异性检测结果如图3所示.

图3 兔抗Glycinin 抗体和β-conglycinin 的免疫交叉曲线

从图3 可以看出，Glycinin 在某一区域出现下降趋势，而β-conglycinin 的（B/B0）%值基本不受浓度的影响，曲线趋势始终保持平稳.这说明βconglycinin 与所制备的Glycinin 抗体之间不存在免疫交叉现象，Glycinin抗体特异性良好.

3 结论

本研究首先成功制备了兔抗Glycinin的多克隆抗体，并在此基础上对间接竞争ELISA 法的条件进行摸索，确定了最佳的反应条件为：抗原Glycinin 最佳包被浓度为0.025 μg/mL，包被4 ℃过夜，抗血清的最适稀释度为1∶3 200，抗原抗体最佳反应条件37 ℃孵育1 h，酶标二抗的最佳稀释度为1 ∶10 000.拟合线性回归直线方程为y=-2.433 7x-4.677 7，相关系数R2=0.991 1，其检测的线性范围为0.01～0.05 μg/mL，检测的板内误差3.82%，板间误差10.22%.结果表明该方法具有一定的重复性和灵敏度，并且操作较为简单.大豆蛋白中Glycinin 抗原的间接ELISA 检测方法的建立，为大豆过敏原及低敏性大豆蛋白产品的开发提供了有效的检测手段.

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