邱 银，叶瑞兴，李英伦

(四川农业大学 动物医学院，四川 雅安 625014)

初生仔猪肠道是无菌的，随着采食和接触周围环境，大量的微生物进入消化道形成复杂的微生物区系并达到平衡。仔猪断奶时由于自身肠道功能发育尚不完善，消化酶分泌不足，免疫系统不健全，抗病能力差[1]，断奶后又受到心理、环境及营养等应激因素的影响，使肠道微生物菌群组成及稳定性受到破坏，导致致病性细菌入侵并定殖，导致仔猪腹泻。

研究表明，中草药可以调整动物肠道菌群结构，改善动物的健康状况。王志祥等[2]在饲料中添加三颗针提取物饲喂断奶仔猪，结果显示，三颗针提取物能够显著提高仔猪日增重(P<0.05)，降低腹泻率(P<0.05)，显著增加空肠、回肠和结肠乳酸杆菌数量(P<0.05)，降低空肠、回肠、盲肠中大肠杆菌和回肠中的总需氧菌数量(P<0.05)。张世昌等[3]用三颗针、黄芪、山楂3味中药制成的复方中药提取物饲喂断奶仔猪，能够显著降低结肠、盲肠中大肠杆菌和大肠中总需氧菌的数量(P<0.05)，同时显著提高大肠中乳酸杆菌和盲肠、直肠中总厌氧菌的数量(P<0.05)。

迄今为止，关于药物或者饲料添加剂对仔猪肠道微生物影响的大部分研究都采用传统的培养基法对菌群数量进行检测，而对肠道微生物菌群结构及多样性的研究报道不是很多。肠道微生物种类多数是不可培养的[4]，采用传统的培养法只能培养出少量的微生物，不能准确反映微生物菌群的多样性[5]。变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 法采用通用引物扩增菌群总DNA 的16S rDNA V3 高变区， 通过分析 V3 区核酸序列多态性获得微生物群落多态性信息，能有效分析复杂微生物群落及其多样性，广泛应用于环境微生态和动物肠道微生态的研究中[6-8]。本研究采用PCR-DGGE技术，分析断奶仔猪日粮中添加中药散剂加味二术散3周内，肠道菌群结构的变化，探讨中药加味二术散预防仔猪断奶腹泻的作用原理，以期为其在生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验药品 加味二术散由白术、苍术、丹参、柴胡、陈皮5味中药组成，按5∶4∶2∶2∶2的质量比混合后，于热风循环干燥箱中50 ℃烘干 3 h，超微粉碎，过孔径0.149 mm的筛子，密封保存，防止药材质量发生变化。

1.1.2 试验动物 30日龄断奶三元杂交(杜×长×大)仔猪 75 头，由四川雅安富强养猪场提供。

1.1.3 主要试剂和仪器Taq酶、dNTPs、pMD18-T Cloning Kit(TaKaRa)，PCR引物(金斯瑞公司合成)，DGGE成套试剂(Bio-Rad)，银染药品和试剂(国药集团)，DNA纯化试剂盒(天根公司)，Poly-Gel DNA Extraction Kit (OMEGA)；JY-SPFT电泳仪(北京君意东方仪器)，T-gradient PCR仪(Biometra)，Dcode DGGE电泳仪、Gel-Doc2000凝胶成像系统(Bio-Rad)。

1.2 试验方法

1.2.1 饲养管理及分组 选取体质量接近(5.5～6.5 kg/头)的 30日龄断奶的健康仔猪75头，随机分为 5 个处理组，每处理3个重复，每个重复5头猪。5个处理为：不做任何处理的空白对照组，分别饲喂在基础日粮中添加0.2%，0.3%和0.5%加味二术散的3个中药处理组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组)以及饲喂在基础日粮中添加0.5%硫酸粘杆菌素的阳性对照组。试验从断奶开始，为期3周。基础日粮营养水平参照美国NRC(1998)断奶仔猪饲料标准配制。在试验前将所用仔猪舍彻底消毒。试验期间猪舍保持清洁干燥，通风良好，仔猪自由饮水和采食，按常规免疫程序进行免疫。

1.2.2 腹泻情况统计 每天 09:00-19: 00 观察仔猪的排粪情况,参考文献[9]对每头猪每次排出的粪便进行感官评分，统计腹泻仔猪头数，计算腹泻率。

腹泻率=腹泻仔猪头数/仔猪总头数×100%。

1.2.3 样品的采集与处理 分别于试验开始第1，2，3周采样，每次剖杀空白对照组、中药添加Ⅱ组、阳性对照组仔猪各1头，在无菌条件下分别采集回肠、盲肠内容物各3管，每管0.5 g左右，置于-70 ℃冰箱中保存备用。

1.2.4 肠道内容物DNA的提取 采用SDS高盐抽提法提取各时间点的各试验组不同肠道样品总DNA，操作步骤按试剂盒说明进行，将提取的总DNA溶于30 μL无菌水中，-20 ℃保存备用。

1.2.5 基因组总DNA 16S rDNA V3区的扩增 参考文献[10]，以样品基因组DNA为模板，采用细菌通用引物GC-338F和518R扩增样品16S rDNA V3高变区序列。引物序列为：GC-338F 5′-GCC CGG GGC GCG CCC CGG GGC GGG GCG GGG GCG CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′和518R 5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′。PCR扩增体系(50 μL)：10×缓冲液5 μL，dNTP (2.5 mmol/L) 3.2 μL，rTaq(5 U/μL) 0.4 μL，GC-338F (20 mmol/L) 1 μL，518R (20 mmol/L) 1 μL，模板DNA 50 ng，补ddH2O至50 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测片段长度。

1.2.6 PCR产物的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析 对PCR扩增产物进行DGGE分析。DGGE用8%的聚丙烯酰胺凝胶，尿素浓度梯度为35%～55%，采用Dcode DGGE系统(Bio-Rad)，电泳缓冲液为1×TAE缓冲液，在60 ℃ 150 V电泳5 h。参照文献[11]的方法用硝酸银染色，Gel-Doc2000凝胶成像系统拍照记录结果。

1.2.7 DGGE图谱中优势条带的克隆与测序 用灭菌的手术刀切下DGGE图谱上差异性条带和共性条带，采用OMEGA 公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的条带。以2 μL回收产物为模板，GC-338F/518R为引物进行PCR扩增。PCR扩增体系(50 μL)：10×缓冲液 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)3.2 μL，rTaq(5 U/μL)0.4 μL，GC-338F(20 mmol/L)1 μL，518R(20 mmol/L)1 μL，模板DNA 2 μL，补ddH2O至50 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。对重新扩增的DNA片段进行2%的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收、纯化后，连接到pMD18-T载体上，并转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，每个回收条带选取3个克隆送华大基因进行测序。将测序结果在GenBank数据库(http：//www.ncbi.nim.nih.gov/blast)中进行Blast比对分析，寻找亲缘关系最近的细菌或克隆。

1.2.8 数据分析 采用Quantity One软件对图像进行处理分析。用戴斯系数(Dice coefficient)计算各泳道样品相似性矩阵，对DGGE图谱中各泳道样品间的相似性进行比较；采用非加权算术平均组对(Unweighted pair group with mathematical averages,UPGMA)算法进行聚类分析；采用Shannon-Wiener多样性指数(H)、丰富度指数(S)对各样品微生物菌群多样性特征进行评价。

2 结果与分析

2.1 加味二术散对断奶仔猪腹泻的防治效果

统计结果显示，空白对照组，加味二术散添加Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组和阳性对照组仔猪腹泻率分别为(32.64±3.18)%，(29.10±2.43)%，(19.48±2.60)%，(16.40±0.92)%和(15.71±1.43)%，其中加味二术散添加Ⅰ组仔猪与空白对照组相比，腹泻率有降低趋势，但差异不显著(P>0.05)；加味二术散添加Ⅱ、Ⅲ组仔猪腹泻率与空白对照组相比极显著降低(P<0.01)，说明该方剂添加0.3%时对防治仔猪腹泻就有明显效果。加味二术散添加Ⅱ、Ⅲ组与阳性对照组仔猪腹泻率差异不显著，说明加味二术散对防治断奶仔猪腹泻效果与抗生素效果相当。

2.2 加味二术散对仔猪回肠、盲肠细菌区系多样性的影响

仔猪回肠、盲肠内容物细菌16S rDNA V3区片段PCR扩增产物的DGGE电泳结果见图1。DGGE图谱上的条带可反映肠道细菌中的优势菌群，条带数量和位置的复杂性反映了菌群的多样性，每个条带代表一种细菌且各泳道相同位置的条带代表同一种细菌，条带的亮度越大说明该细菌的数量越多，为肠道内的优势菌群。由图1可知，DGGE指纹图谱上有很多共同条带，同时也存在差异性条带，如图中条带1，3，4，6和9等为特异性条带，10，13，20和22等为共性条带。表明不同处理组仔猪在断奶第1周有相同细菌同时定植在回肠和盲肠上。随着日龄的增长，不同处理仔猪各肠段优势细菌发生改变，又有不同的细菌定植在肠段上。

断奶仔猪回肠、盲肠DGGE条带数和多样性指数见图2和图3，从DGGE图谱条带数来看，仔猪消化道不同部位细菌的组成不一样，盲肠DGGE电泳条带数多于回肠，说明盲肠肠道菌群较回肠丰富，微生物多样性高于回肠。断奶后3周内加味二术散添加Ⅱ组和阳性对照组回肠、盲肠DGGE条带均多于空白对照组，说明添加加味二术散或抗生素都可增加回肠和盲肠的微生物种类，提高回肠和盲肠菌群多样性。中药添加Ⅱ组和阳性对照组回肠微生物多样性都是先增加后略微减少，差异不明显，到第3周菌群结构趋于稳定。中药添加Ⅱ组盲肠微生物多样性一直呈增加趋势，阳性对照组盲肠微生物多样性先增加后减少。

图1 加味二术散对断奶仔猪回肠、盲肠细菌区系多样性影响的PCR-DGGE分析

图2 添加加味二术散后仔猪回肠细菌区系DGGE条带数和多样性指数

图3 添加加味二术散后仔猪盲肠细菌区系DGGE条带数和多样性指数

2.3 加味二术散对断奶仔猪回肠、盲肠DGGE图谱相似性的影响

利用Quantity One软件经UPGMA算法得出DGGE指纹图谱的聚类分析树状图(图4)。从图4可见，随着日龄的增长，相同处理、相同肠段细菌区系的相似性增高。相同日龄不同日粮处理组回肠与盲肠肠段微生物区系的相似性较低，说明不同处理后不同肠段菌群结构存在一定差异。回肠段，相似性最高的是阳性对照组的第2周和第3周，相似性达到86%；其次是中药添加Ⅱ组的第2周和第3周，相似性达到82%。盲肠段，中药添加Ⅱ组第2周和第3周相似性最高，达到79.1%；阳性对照组盲肠各时段相似性均较低，第1周与第2周相似性为38.6%，第2周与第3周相似性为48.8%，说明日粮中添加抗生素后肠道菌群变化明显；同样，空白对照组盲肠各时段微生物区系的相似性也不是很高，第1周与第2周相似性为47.9%，第2周与第3周相似性为40.4%。

图4 添加加味二术散后断奶仔猪回肠、盲肠细菌区系DGGE图谱相似性分析

2.4 DGGE图谱中部分条带的克隆测序及其对应菌种的鉴定

对DGGE图谱中部分优势条带、特异性和共性条带进行克隆测序，在GenBank中进行比对，获得各条序列的同源性信息，结果见表1。从表1可以看出，这些优势、特异、共性条带所代表的菌种都能在GenBank数据库中找到同源性较高的细菌，而且条带1，4，9，13和20与相应菌株的相似度均达到100%，其余条带相似度也很高；除了1个克隆(条带9)为不可培养细菌外，其余克隆的最相似菌主要来自于厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)。

表1 添加加味二术散后断奶仔猪回肠、盲肠段细菌DGGE图谱中部分条带的序列分析

3 讨 论

动物胃肠道内寄生着种类繁多、数量巨大的微生物，构成了动物胃肠道的微生态系统。正常的微生物菌群是动物生存的必要条件，其结构的多样性及种群结构的变化影响着动物肠道正常的生理功能及机体的健康状况。正常的肠道菌群可以抵抗病原菌的侵入，发挥屏障作用，促进机体对营养物质的消化吸收，影响消化道的结构、发育，协助机体产生免疫应答[12]。断奶仔猪肠道微生物区系很不稳定，生理、环境、营养等断奶应激条件的改变都可以导致仔猪肠道微生物菌群结构变化，导致疾病的发生。

本研究结果表明，仔猪日粮中添加加味二术散可以降低仔猪腹泻率，其中以添加0.3%和0.5%加味二术散组效果极显著(P<0.01)，表明日粮中添加加味二术散可防治断奶仔猪腹泻。中草药能够防治仔猪腹泻，可能是由于中草药中含有的多糖、有机酸、生物碱、甙类和挥发油类成分能够直接杀菌、抑菌，增加机体免疫力。本试验中加味二术散选用苍术、白术、柴胡、丹参、陈皮5味中药组方，其中苍术主要成分有苍术素、茅术醇和桉叶醇等，现代药理研究表明，苍术可以双向调节胃肠道运动，具有保肝、抗菌、抗炎等作用[13]。白术的主要成分是挥发油，其中白术内酯Ⅰ可以健脾运脾、增强唾液淀粉酶活性、促进肠管吸收、调节肠管功能；白术挥发油可能具有促进胃肠道运动的作用，白术多糖是一种免疫调节剂，有助于提高免疫力[14]。柴胡主要成分有柴胡皂苷和柴胡多糖，具有抗炎作用，可增强免疫功能[15]。丹参提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌、福氏痢疾杆菌和伤寒杆菌等均有不同程度的抑制作用[16]。陈皮含有许多氨基酸及K、Na、Ca等多种微量元素、矿物质元素和动物机体所必需的营养元素，如肌醇、VB1、VC等；另外，陈皮中的橙皮苷有抑制微生物活性的作用[17]。

本试验运用PCR-DGGE技术分析了加味二术散对断奶仔猪肠道微生物菌群结构的影响，结果显示，肠道不同部位具有不同的细菌类群，与盲肠相比，断奶仔猪回肠内微生物的种类相对较少(包括有益菌和有害菌)，说明盲肠是微生物大量生长和繁殖的重要场所，盲肠内微生物多样性高于回肠。日粮中添加加味二术散和抗生素后，断奶仔猪回肠、盲肠细菌总数都增加。这与Collier等[18]的报道不一致。Vance等[19]则报道,小鼠肠道微生物多样性不受头孢甲氧霉素的影响，这很有可能与添加的抗生素种类不同，其对肠道的选择性作用不同有关。

日粮中添加中药散剂加味二术散，仔猪断奶后第1周和2周回肠肠道菌群发生了很大变化，到第3周各处理组DGGE图谱趋于稳定，这与朱伟云等[20]的报道一致。日粮中添加抗生素后回肠肠道菌群变化与添加中药效果相同，而盲肠肠道菌群在试验3周内变化很大。说明加味二术散可促进断奶仔猪肠道菌群趋于稳定。

对仔猪不同肠段特异性和共性条带的克隆测序结果证明，消化道部位对菌群组成有一定影响。因为DGGE方法的限制，本试验只能检测到样品中含量在10%以上的细菌[21]。盲肠的特异性条带很多，如条带3，17和33等，说明其对应菌群在回肠中含量较少或者不能在回肠中定殖。添加中药散剂后有新的菌种出现，如条带22，23等。测序结果表明，添加抗生素虽然增加了肠道微生物的多样性，却也抑制了一些有益菌(如条带20所代表的细菌含量下降)，而且有害菌增加(如条带35所代表的细菌含量增加)。

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