廖 萱，兰长骏

(川北医学院附属医院眼科，四川 南充 637000)

近视是一种常见的屈光不正，在全世界范围人群中有很高的发病率。近几十年来，近视的发病率和严重程度均呈快速增加的趋势，尤其以包括中国在内的东亚国家的青少年儿童表现更为明显。随着近视度数增加和眼轴延长，发生眼部病理性改变和合并症的风险亦明显增加，甚至可以发生不可逆的视功能丧失的严重后果，同时带来沉重的社会负担和经济负担，成为重要的全球性公共卫生问题[1]。近视的病因和发病机制仍未完全阐明，寻求有效的防治方法一直是眼科和视觉研究的难点和热点。普遍认为单纯性近视是遗传-环境因素的多向相互作用(基因-基因累积作用/基因-环境交互作用)引起的多基因复杂疾病，遗传因素对于近视的发生发展极其重要。然而在易感基因的定位和遗传分析中仍存在很多悬而未决的问题。现代分子生物学和遗传学技术的革命性进步，提供了一个前所未有的机会来破译近视的病因和发病机理。随着研究越来越深入，遗传标记已从细胞学标记和生化标记发展到能够直接反映DNA分子水平差异的分子标记，寻找遗传易感基因突变位点的策略由定位克隆改变为采用全基因组扫描策略，下一代测序技术消除了罕见变异检测的技术障碍，基因组的研究重心由结构向功能研究转变，近视的遗传学研究已经进入一个全新的阶段。

1 遗传标记

遗传标记(genetic marker)是用来区分不同的个体或种群，能够稳定遗传的性状或物质，是遗传分析不可缺少的重要工具。从广义的角度，指反映遗传多态性且遵循遗传规律的全部生物特征；从狭义的角度，指反映个体或群体间基因组差异的DNA位点或序列。自19世纪中期Mendel首先将豌豆形态学性状作为遗传标记以来，其逐渐得到发展和丰富，形态学、细胞学、生物化学及免疫学标记等被广泛应用。DNA分子标记(molecular marker)直接反映核酸水平上的遗传变异，消除了环境影响，遗传稳定且信息量大，是目前的主要的遗传标记。DNA分子标记经历了以下几个阶段的发展。

1.1 限制性片段长度多态性

1974年Grodzicker等[2]首次提出将限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)用作腺病毒温度敏感突变的遗传标记，开创了直接应用DNA多态性作为遗传标记的新阶段。1987年人类基因组第一张RFLP标记图谱发表，RFLP作为第一代DNA分子标记开始被广泛应用。由于DNA序列上限制性内切酶位点的碱基发生突变或替换，使得原有酶切位点消失或产生新的酶切位点；或限制性酶切位点之间发生了碱基的插入或缺失，使得酶切位点相对位移或DNA内部结构发生重排。因此，用限制性内切酶消化后就会产生长度不同的DNA片段，即RFLP。这些不同大小DNA片段，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或者Southern blot转膜杂交后，即可以分出不同的基因型，从而揭示出遗传位点的多态性。由于RFLP多态性标记的等位基因具有共显性的特点，易于区分纯合型和杂合型，并且结果稳定可靠，因而在近视的易感基因位点筛选中得到广泛应用，鉴定出一些高度近视候选基因。但由于RFLP检测较难自动化，在全基因组上的分布密度较低，多态性频率也较低，使得应用受到一定的限制。

1.2 微卫星多态性

1989年Litt等[3]发现了微卫星多态性(microsatellite polymorphism，MP)在人心肌肌动蛋白基因中的存在，MP作为第二代DNA标记开始被认识。微卫星也称简单串联重复(simple sequence repeats，SSRs)或短串联重复(short tandem repeats，STRs)，由核心序列和侧翼序列组成。核心DNA序列呈串联重复排列，重复单位一般由2～6个核苷酸构成，重复次数n为几次到数十次，以(CA)n、(AAAN)n、(AAN)n和(GT)n较为常见；侧翼DNA序列位于核心序列的两端，为保守的特异单拷贝序列，能使微卫星特异地定位于染色体常染色质区的特定部位。微卫星产生的机制被认为是由复制滑脱(replication slippage)或DNA滑动链与互补链碱基错配，导致一个或几个重复单位插入或缺失而产生。MP因不同的重复单位以及不同的重复次数构成多态性，使其在不同人群、不同种族间分布具有差异性。微卫星标记的检测通常通过分析PCR扩增产物有无特异性带型，并比较扩增产物的大小的方式，检测出不同个体在每个微卫星座位上的遗传结构。虽然MP标记具有分布广泛、信息丰富、检测相对简便而高效等优点，被广泛地用于高度近视易感位点研究，但是可能出现同源异型或异源同型，以及无效等位基因，也给微卫星DNA标记技术的应用带来困难。

1.3 单核苷酸多态性

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)作为第三代DNA分子标记开启了新的分子标记时代[4]。1998年Wang等[5]首先报道了根据SNP技术建立的人类遗传图谱。SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸碱基的变异所引起的DNA序列多态性，在人群中这种变异的发生频率一般大于1%；而小于1%被认为是点突变。通常把人类基因组中最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)>5%的SNP称为常见变异，≤5%为稀有变异或低频变异。在基因组DNA中的任何碱基均有可能发生变异。在蛋白质编码区的SNP和位于表达调控序列中的SNP在功能或致病方面具有更重要的意义，常常被称为功能多态。SNP分布并不均匀，由于选择压力等原因，绝大多数SNP位于非编码区，位于基因组中蛋白质编码的序列仅约为3%。

SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上[6]。据估计在人类基因组中两个无亲缘关系的个体间平均每1000个核苷酸中就有一个以上的SNP，因此整个人类基因组中存在300万个以上的SNP，覆盖全基因组的0.4%[5]。SNP位点并不是独立遗传的，而是一组位置比较接近的且几乎不发生重组的连锁不平衡SNP位点(即单体域haplotype block)一同遗传。虽然SNP在任一特定位点上只有两个等位基因，所涵盖的信息量有限，但是SNP在基因组中数量巨大且分布频密，所以整体而言其多态性远高于RFLP与MP；而且SNP是基于单核苷酸的突变，遗传稳定性相对较高，具有比MP更准确的优势[7]。其二态性易于基因分型和等位基因频率估计，适合复杂疾病的易感基因或致病基因研究。

1.4 拷贝数变异

人类基因组遗传变异有许多种形式，从显微镜可见的染色体到微观的单核苷酸突变，也有许多DNA片段大小为kb到Mb范围内亚微观的拷贝数。2004年Sebat[8]和Iafrate[9]各自所在的研究小组首次在人类基因组中描述了拷贝数变异(copy number variation，CNV)的存在，指出有两个大片段的CNV可以导致出生缺陷等重大疾病，其多态性也成为一种新的遗传标记在人类基因组中被广泛地研究。之后，更多的研究小组发现CNV与疾病有着密切的联系。CNV是基因组结构变异的一种形式[10]。与SNP类似，CNV除了一部分会致病以外，也可以作为一种遗传多态性存在于人类及其他物种的基因组上。相对于SNP的概念，将人群中等位基因频率大于1%的CNV定义为基因组拷贝数多态(copy number polymorphisms,CNP)，90%以上的CNV属于这一类型，而小于1%的CNV称为罕见CNV。

人类基因组内大约存在1 500个CNV区域，覆盖基因组的12%[11]。CNV产生的机制与减数分裂时期的DNA重组、DNA毁坏后的错误修复、DNA移动元件的活动等有关。CNV为揭示生物遗传和变异的分子基础提供了新的思路。虽然目前发现的人类基因组中SNP的个数远远高于CNV，但CNV在整个基因组中覆盖的核苷酸总数却大大超过SNP的总数，结合这两种遗传标记进行研究，将为认识人类基因组的构成、个体间的遗传差异、遗传致病因素提供新的线索，深入理解复杂疾病的分子机制和遗传基础提供理论依据。

2 大型国际基因组项目

从50年代的遗传物质结构模型的提出，到90年代开始的国际人类基因组计划兴起的基因组学革命，科学家们一直致力于解读人类遗传的信息，揭开人类奥秘的基础。随着大型国际基因组项目的相继开展与完成，人类基因组研究已经成为生命科学发展的主线，对于包括近视在内的多种疾病遗传研究起着重要的推动作用。

2.1 国际人类基因组计划

国际人类基因组计划(the international human genome project，HGP)[12]于1990年启动，旨在阐明人类基因组30亿核苷酸的序列，发现所有人类基因并阐明其在染色体上的位置，使得人类第一次在分子水平上全面地认识自我。2003年个人完整基因组序列图谱的绘制，提供了研究基因结构和功能的基础。直至2006年人类最后一个染色体-l号染色体的基因测序结果公布，HGP经历16年，图谱精确度覆盖了人类基因组的99.99%。同时人们发现，完成的HGP只是一个以测序为主的结构基因组学研究，真正揭示基因组的功能也许是整个21世纪的任务。HGP的内涵及外延在不断地扩展。

2.2 国际人类基因组单体型图计划

国际人类基因组单体型图计划(the international HapMap project，HapMap)[13-14]相继在2002年启动，构建了人类基因组中常见遗传变异的等位基因和基因型频率以及单体型形式，提供了洞察人类基因组差异的窗口和关联研究的有力工具。HapMap分别在2005年和2007年公布了第Ⅰ和Ⅱ期的数据，分别对4个种群的270个个体样本，超过100万SNP和200万SNP进行基因分型；在2010年公布了第Ⅲ期的数据，增加了6个种群，样本扩展到1 115个个体，检测SNP约155万个，基因分型的精度已达单个核苷酸水平。所有数据免费向公众开放并发布在共享数据库(www.hapmap.org)。受前期的测序技术所限，HapMap计划仅对人类基因组中常见遗传变异的SNP位点进行基因分型。随着高通量基因分型和测序技术的发展以及千人基因组计划的展开，人类遗传学研究进入了一个新的时代。

2.3 千人基因组计划

千人基因组计划(the 1 000 genomes project，1 000 Genomes)[15-16]自2008年启动，目标在于组装大量个人的基因组全序列数据，绘制出最为详尽的人类全基因组遗传多态性图谱，提供更精确全面的遗传变异信息和人类基因组结构变异的公共数据库(www.1000genomes.org)。通过研究数以千计的个体，建立不同人种中所有常见变异及绝大部分稀有变异的深度目录，有助于更广泛地分析与疾病有关的基因变异。第一阶段研究进行三项前期实验，旨在评估研究覆盖率、方法、平台和机构，以确定全基因组测序的最好策略。第一项实验包括对2个核心家庭的基因组进行的全基因组测序；第二项包括对来自4个种群的179个体进行全基因组测序；第三项包括对来自7个种群的697个体进行外显子测序。前期数据已在2009年发布。第二阶段计划对7个种群的2 500个体的基因组进行4×覆盖度测序和外显子靶向测序，目前也取得了阶段性成果，2012年公布了包含14个国家和地区1 092人的基因数据的高分辨率人类基因组遗传变异整合图谱。从人类基因组计划耗费10多年才绘出个人的完整基因组图谱，到千人基因组计划短短4年间就已获得超过1 000人的基因组数据，见证了基因组研究的高速发展，在全基因组范围内筛检与疾病相关的遗传变异成为可能。

2.4 DNA元素百科全书

然而HGP发现基因组中仅有1.5%的序列是给蛋白质编码的，而对其余98.5%的序列知之甚少。为了完成HGP遗留的任务，2003年启动了又一项大型国际合作项目——DNA元素百科全书(Encyclopedia of DNA Elements，ENCODE)[17]。ENCODE项目旨在识别出人类基因组序列中的所有功能元件，包括转录、转录因子联合、染色质结构和组蛋白修饰区，绘制人类基因组甲基化可变位点的表观基因组图谱。对至少147种细胞类型进行了1 648项计算机分析、生物化学试验以及测序研究，目前已经确认约80%的基因组都具备某种功能，包括7万多个启动子区，负责与蛋白质结合控制基因表达；近40万个增强子区，负责调节远距离基因的表达。研究者分离了基因组中转录的RNA并进行测序，识别出约120种转录因子的DNA结合位点，作用相当于控制基因活性的开关；绘制了基因组中被甲基团覆盖的区域图，被甲基团覆盖通常表明这里的基因是沉默的；检验了组蛋白的化学修饰方式，这种修饰有助于将DNA包装成染色体，增强或抑制基因表达区；用DNaseI的酶绘制了125个细胞型中的调节区，这种酶对与组蛋白结合的DNA影响很小，却会切断与其他调节蛋白连接的DNA，如转录因子。ENCODE历时十年的工程取得重大进展，将进一步诠释遗传变异调控的机制，对生命科学研究领域产生深远的影响。

3 遗传学研究方法

染色体不能直接用来测序，因此首先要将基因组分解为较易操作的小的结构区域，这个过程简称为作图(mapping)，是遗传学研究的主要方法，分为遗传图和物理图，在此基础上整合并引入基因标志形成转录图或基因图。利用遗传作图进行连锁分析(linkage analysis)和关联研究(association study)是寻找近视致病基因的主要策略。

3.1 连锁分析

连锁分析通过鉴定经多代传递仍完整的单体型为基础，检测在一个家系中等位基因和疾病的传递是否相关。迄今为止，已识别出人类基因组中近视相关的基因片段三十多个，经国际人类基因命名委员会通过并已在OMIM数据库(www.ncbi.nlin.nih.gov/omim)编码的基因位点共有23个(MYP1～MYP23)。这些易感区域分布在绝大多数染色体上，主要为常染色体显性遗传，少数是常染色体隐性(MYP18)或性连锁隐性遗传(MYP1、MYP13)。部分基因位点多次被后续研究证实，为近视的遗传异质性研究提供了有力的证据。

另外有一些新鉴定的位点尚未被OMIM收录。Wojciechowski等[18]在旧时阿米什人(Old Order Amish)和高加索人近视家系中进行全基因组连锁分析(genome-wide linkage study，GWLS)研究，发现5qter与旧时阿米什人近视相关，12q24和4q21与高加索人近视相关，进一步meta分析显示4q21-22在已知的MYP9和MYP11位点附近。Abbott[19]采用GWLS和数量性状位点(quantitative trait locus，QTL)定位，在迄今最大规模的高度近视家系样本中，鉴定出两个新的潜在位点6q13-16.1和5q35.1-35.2，同时也验证了先前的近视相关位点。然而复杂疾病具有多种因素参与疾病的进程，单个基因的作用效应微弱，遗传异质或表型异质性，外显不完全或拟表型，遗传传递机制不确定等特点。虽然连锁分析对于发现主效基因十分有效，但是对于中效或微效基因的检出率较差；基于高度近视家系发现的高外显率位点，难以代表散发近视病例的低外显性突变；所定位区域往往包含众多信息，确定具体的易感基因或位点尚需要大量的工作。因此，连锁分析虽然在单基因遗传病的基因定位方面取得了较大的成功，但是难以定位表型影响效应较小的遗传变异，也难以对易感基因和致病变异进行精确定位，从而限制了连锁研究在寻找近视致病基因中的作用。

3.2 候选基因关联研究

关联研究是通过鉴定经数代传递后仍保留完好的相邻近DNA变异之间的DNA片段，检测在一个群体中等位基因与疾病的相关性是否存在。因此，关联研究也可视作是在未观察到的、可能存在的家系中进行的大规模的连锁分析。关联研究依据连锁不平衡的原理，通过遗传标记在不同群体中的分布差异来揭示其与疾病的质量或数量性状间的关系，从而发现与疾病相关的遗传标记。

候选基因关联研究(candidate gene association study)基于整合信息学策略，包括功能候选策略，即通过病理生理功能信息进行功能分析及或已知功能基因的同源比较；或者位置候选策略，即通过基因图谱信息进行初步或精细定位；以及利用比较组学信息或挖掘文献数据进行候选，搜寻致病相关的候选基因进行关联研究。目前近视遗传关联研究的候选基因主要涉及两大类：巩膜细胞外基质生长和重塑的相关基因，如蛋白聚糖类(proteoglycans[20])，胶原类(collagens[21])，纤维蛋白类(fibrillarin[22])，细胞黏附迁移相关的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases[23])以及类尿调节素I基因[24]，生长因子及其受体(growth factors and their receptors[25])；以及视网膜视觉信号处理和传输的相关基因，如夜盲蛋白NYX基因[26]，血管活性肠肽受体VIPR2[27]，维生素D受体VDR[28]等。这些被鉴定的近视相关候选基因和位点中，很少处于先前已经鉴定的非综合征近视的连锁峰值中，在不同的研究中结果并不能被重复验证。而且这种假设驱动的方法(hypothesis-driven)只针对已知的候选基因，未能从整体角度系统考察基因组所有的遗传变异，在探寻高度近视致病基因方面难以有重大的发现和突破。

3.3 全基因组关联研究

全基因组检测的无偏特性(hypothesis free)加上关联研究的统计效能的提高，高通量基因分型技术和新兴生物统计学方法的迅猛发展，全基因组关联研究(genome-wide association studies，GWAS)成为目前探索复杂疾病遗传易感因素最为有效的研究办法。迄今已有数项GWAS对近视遗传易感基因SNP位点进行了探索，不仅验证了既往候选基因关联研究发现的高度近视候选基因,还鉴定出多个近视相关的新易感区域或位点，极大地更新了对近视遗传背景的认识[29-35]。后期的GWAS更联合国际和国内多中心研究，采用数以万计的大样本量，协同遗传统计学和生物信息学等多学科，显著地提高了统计效能，获得更多的遗传信息。

Verhoeven等[34]以分别来自27个欧洲研究队列和5个亚洲研究队列的45 758名屈光不正人群为研究对象，利用Illumina和Affymetrix平台鉴定出与屈光不正相关的24个新位点。通过评价作为活性调控因子标志的H3K27a修饰和HaploReg注释的乙酰化，发现许多关联位点包含有这些调控因子，推测调控功能可能也是一个潜在的机制。这些发现更深化了对近视发病机制的认识。Kiefer等[35]在欧洲人群中进行了迄今为止最大的近视GWAS，包含两阶段的研究对象共54094例，鉴定出20个与ECM重塑、视觉循环、眼球生长以及视网膜神经元发育或信号的联系等与近视发生发展相关的新易感位点/基因。最显著关联位点rs12193446位于LAMA2基因的内含子内，风险比(hazard ratio，HR)及可信区间为0.79(0.76，0.81)。研究构建了Cox比例风险回归模型进行近视初始发病年龄的全基因组生存分析，结果支持视觉诱发信号激发的视网膜到巩膜的级联反应导致近视发生发展的模式，提示早期的眼球和神经元发育对于人类近视的发生发展的重要性。GWAS已经产生了海量数据，有待进一步地处理和有效地利用。

3.4 下一代测序

GWAS基于“常见疾病/常见变异”(common disease common variants,CDCV)假说[36]，并未涵盖人类基因组中稀有遗传变异和其他结构变异。由于自然进化中选择压力的存在，稀有变异往往是新近发生的效力较强的有害变异[37]。不断涌现的研究结果表明，稀有遗传变异对某些复杂疾病的发生起着关键性的作用，解释基因-变异-环境因素之间的相互作用关系需要对更多微效基因稀有变异进行研究。目前GWAS所研究的对象主要是SNP，对SNP以外的其它结构变异并不敏感，例如MP及CNV等等，这些变异包含了多个核苷酸，往往可以影响到基因的表达，因此可能涉及相当一部分复杂疾病的遗传易感性。对于MAF≤5%甚至MAF≤5‰的稀有遗传变异以及其他结构变异的探索和研究，将随着下一代测序技术(next generation sequencing，NGS)的发展逐渐深化。

全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)可以鉴定人类基因组序列的所有变异，但目前成本仍然较高；外显子组测序(whole exome sequencing，WES)相对成本低，可以系统分析基因组中蛋白编码区域的主要遗传变异[38]。通过WES技术，Shi等[39]已经鉴定出近视位点MYP21(1p22.2)并被OMIM数据库收录(OMIM 614167)；最近两项研究分别鉴定出LRPAP1基因的突变[40]，以及SCO2基因终止密码子突变c.157C>T[41]与高度近视有关。目标区域再测序(targeted resequencing)在已经鉴定的连锁峰值区域进一步测序分析，也是成本相对较低的有效手段。Mordechai等[42]通过对以色列贝都因人常染色体隐性遗传的高度近视家族进行全基因组连锁研究以及目标区域再测序，将高度近视易感位点定位与染色体3q28上1.7Mb的区域。利用新一代测序技术，针对全基因组、外显子组或GWAS识别的候选易感区域进行高通量测序和关联分析，继而在独立人群中验证，有望快速准确识别已有变异并有效发现新的低频和罕见变异。

4 展望

分子生物学技术的进步为近视遗传学研究提供了新的手段，近视基因组学研究已经取得了重要进展并积累了海量的研究数据，下一代测序技术也将随着更高通量和更低成本在近视的遗传学研究中发挥更大作用。而完全揭示近视遗传机制，并最终实现近视的个体化医疗，仍然面临许多挑战。

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