乔建援，赵 峰，齐笑飞，孙沛勇，杜风光

(河南天冠企业集团有限公司 试验中心，河南 南阳473000)

0 引言

1，3-丙二醇(1，3-propanediol，以下简称PDO)是一种重要的精细化工原料，主要用作合成聚酯和聚氨酯的单体等［1］． 近几年的研究表明，以PDO 为单体合成的对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)具有优良的加工、染色等性能［2］，可以广泛地应用于纺织工业．最近十几年国际市场上甘油的生产过剩，也促进了甘油生物转化法生产PDO 的研究．和化学法相比，微生物转化法具有安全、环保和可持续发展性，特别是随着石化资源的日益枯竭，生物基化学品的研究不断升温，微生物转化法生产PDO 已成为研究的热点［3-4］．

陶春平等研究表明［5］:培养基中氮浓度较低时，菌体生长和产物生成都会因氮源不足受到影响;氮源浓度较高时会导致菌体过度生长和副产物的大量生成，降低PDO 的最终浓度以及甘油生产1，3-丙二醇的转化率． 笔者在进行产业化评估时发现，以目前的培养基配方来进行产业化，不仅成本高，而且在氮源的添加方面没有一个较好的控制方式，这必将制约PDO 的产业化．

笔者从培养基成本及氮源的控制角度出发，研究了3 种不同的有机氮源、无机氮源用量情况以及不同的补加方式下对发酵法生产1，3-丙二醇的影响．

1 实验部分

1．1 菌株与培养基

克雷伯氏肺炎杆菌:河南天冠企业集团有限公司车用燃料生物技术国家重点试验室保存．

种子培养基(g/L)［6］:K2HPO4·3H2O 7．0，(NH4)2SO44．0，KH2PO42．0，MgCl2·6H2O 0．1，酵母浸粉1．0，微量元素液0．3 mL，pH 值7．0．

发酵培养基(g/L):K2HPO4·3H2O 6． 8，NaH2PO4·2H2O 1．38，(NH4)2SO43．5，MgSO4·7H2O 0．26，酵母浸粉1．0，微量元素液0．3 mL，pH 值7．0．

1．2 试剂和仪器

化学试剂均为市购，分析纯;酵母浸粉为安琪FM801;玉米浆粉为上海西王淀粉糖有限公司产品;全脂黄豆粉为本地黄豆经粉碎而成．

全自动发酵罐为上海国强生化装备有限公司出产．摇床采用上海智诚ZHWY -2112C 型． pH监测采用Mettler Inpro2000 型电极，M400 变送器．

1．3 培养方法

种子培养条件:三角瓶装液量50 mL/250 mL，摇床培养温度37 ℃，转速175 r/min ，培养时间12 h．

发酵采用50 L 全自动发酵罐，初始发酵培养基体积35 L，接种量1%(质量分数)，初始甘油浓度25 g/L，发酵液pH 值6． 3，发酵温度37 ℃，转速120 r/min，风量为0．56 Nm3/h． 采用2 mol/L 的氢氧化钠溶液控制发酵过程中pH 值，过程流加甘油，发酵时间48 h．

1．4 分析方法

1．4．1 生物量

生物量通过测定发酵液在650 nm 下的吸光度值转换所得．分光光度计采用Unico722 型．

1．4．2 化学成分的测定

甘油、PDO 及副产物中的有机酸［7］采用高效液相色谱法测定．高效液相色谱为安捷伦1200．

1．4．3 氨氮的测定方法

氨氮的测定采用HJ 535—2009［8］中的碘化汞-碘化钾-氢氧化钠法测定，添加酒石酸钠钾来消除金属离子的影响． 分光光度计采用Unico722 型．

2 结果与讨论

2．1 初始氮用量对PDO 生物合成的影响

通过试验发现，如果降低初始氮用量，会延长菌体的对数生长期，且PDO 的最终含量也较高．因此，选择基础培养基中初始氮用量的50%、75%、100%(质量比)为条件，保持3 种条件下发酵全过程总氮用量相同，研究了初始氮用量对发酵的影响，结果如图1 所示．

图1 不同的初始氮用量对发酵的影响Fig．1 Effects of different initial nitrogen content in the fermentation

由图1 可知，当初始氮用量过低时，PDO 合成明显放慢，且操作中，补氮时间明显提前，在9 h左右就必须补入氮源，补氮后菌浓出现了快速提升．由于菌体处于亚健康状态，50%的初始氮用量下的最终PDO 的合成远低于另两种方式．而初始氮用量100%的条件下，菌体的增长明显较快，但PDO 的增长低于75%的状态．

同时测量了不同初始氮用量下的培养基在消毒前后的氨氮含量，如表1 所示． 从表1 可以看出，起始氮源用量高时，氨氮的损失也大，消毒后培养基的颜色也较深．因此认为，消毒时在高温的作用下氨氮与培养基中的糖分发生美拉德反应，从而损失了部分氨氮，产生了氨基糖，造成了发酵液颜色加深．

表1 不同初始氮用量下氮源的损失率Tab．1 The nitrogen loss rate of different initial nitrogen by disinfection treatment

2．2 纯无机氮对PDO 生物合成的影响

在做学术研究时，试验方案中可以采用优质的氮源为原料，但大生产中高成本将是一个新产品进入市场的关键制约因素．因此，笔者试验了纯无机氮源对PDO 生物合成的影响，结果如图2 所示．

图2 纯无机氮源对PDO 生物合成的影响Fig．2 Effects of pure inorganic nitrogen sources on PDO biosynthesis

试验组选用了初始氮用量的75%，两次间隙补加无机氮源，保持总氮用量不变，对照组也为初始氮用量的75%． 图2 的对比试验表明，纯无机氮对菌体生长基本没有影响，但PDO 合成速度低，且合成滞后，发酵终了PDO 的含量低．表明纯无机氮无法提供产物合成用的一些微量生物因子．

2．3 有机氮对PDO 生物合成的影响

针对工业中常使用的几种有机氮源，笔者选用安琪酵母浸粉、西王玉米浆粉、全脂黄豆粉等3 种有机氮源进行了对比试验，试验结果如图3 所示．

图3 等量有机氮下对发酵的影响Fig．3 Effect on Fermentation of equal amount of organic nitrogen

试验表明，相同用量下后两者比酵母浸粉差．因此，笔者对不同氮源的添加量进行了优化，结果如图4 所示．通过优化试验发现，3．0 g/L 玉米浆粉、2．5 g/L 的全脂黄豆粉与1．0 g/L 酵母浸粉的PDO 生物合成结果相当．但全脂黄豆粉虽提供了充足的有机物，却在发酵中产生了大量的泡沫，对发酵的影响较大，因此，玉米浆粉是PDO 产业化中的最佳选择．

图4 优化后不同有机氮对发酵的影响Fig．4 Effect of different organic nitrogen on fermentation after optimizing

2．4 补加方式对PDO 生物合成的影响

为了分析氮源浓度对发酵的影响，笔者试验了3 种补加方式:二次间隙补料、连续稳定的补加、与pH 值耦合补加，试验结果如图3 所示． 试验表明:常用的二次间隙补料存在着氨氮浓度的起伏，对菌株的生长不利;而连续稳定的补加方式，在发酵中前期发酵液氨氮含量会逐渐下降，使PDO 合成较慢，而后期最终发酵液中氨氮含量的增加，不利于废水的处理．

随后笔者选用了与pH 值调控耦合的补加方式，分析了发酵过程pH 值与氮源消耗的变化规律．该补加方式前期主要产乙酸，乙酸有利于PDO 的生成［9］，此时氮源消耗随碱液消耗的增大而增大，后期产乳酸，氮源消耗与碱液消耗基本没有关系．因此，笔者选择了前24 h 与pH 值的调控耦合补加氮源，而后期停止补加的方式，并取得较好的发酵结果，试验结果如图5．

图5 3 种补加方式下氨氮的变化曲线Fig．5 Variation curves of ammonia nitrogen in three feeding mode

图6 3 种补加方式的发酵的影响Fig．6 Effects of three kinds of adding method in fermentation

试验表明:连续补加有利于氨氮含量的稳定，对菌株生长及PDO 生物合成有利;而与pH 值调控相耦合的补加方式，更有利于发酵料中氨氮含量的稳定，有利于大生产中的操控．试验证明，采用与pH 值调控相耦合的方式，PDO 的最终含量提高到72．5 g/L．

3 结论

(1)本试验表明，纯有机氮只能提供菌株生长需要的氮源，但无法提高PDO 的产量，说明必要的有机氮源添加是促进PDO 生物合成的有效方式．

(2)初始氮含量的控制不仅有效地减少氮源的损失，而且能促进菌株转化甘油为PDO，提高最终发酵液中PDO 的含量．氮源与糖类物质的美拉德反应所产生的物质是否会阻碍菌株合成PDO 仍有待研究．

(3)3．0 g/L 的玉米浆粉与1．0 g/L 的酵母浸粉均能有效地促进甘油转化为PDO．说明玉米浆粉可以成为工业大生产中的有机氮源，从而降低产品的生产成本．

(4)氮源的补加方式是PDO 生物合成的一个重要的影响因子，控制稳定的氮源浓度使得PDO的生物合成可以得到显著的提高． 采用与pH 值调控相耦合的补加方式能有效地稳定发酵液中的氮源浓度，使PDO 的最终含量达到72．5 g/L．

［1］ 刘德华，刘宏娟，程可可． 微生物发酵法生产1，3-丙二醇研究进展［J］．合成纤维，2005，(6):11 -15．

［2］ ZHANG Zong-ming，HU Qiu-long． Statistical optimization of culture conditions for 1，3-propanediol by klebsiella pneumoniae AC15 via control composite design［J］．Bioresonce Technology，2008，99:1052-1056．

［3］ 刘婷，刘均洪，刘登． 微生物转化甘油生产1，3-丙二醇的研究进展［J］．上海化工，2010(4):24 -27．

［4］ 张文斗，孟宋冬，马春玲，等．微生物法生产1，3-丙二醇的研究进展［J］． 山东轻工业学院学报，2011(4):11 -14．

［5］ 陶春平，刘朋波，宫衡，等． 控制氮源浓度提高1，3-丙二醇的发酵水平［J］． 化学与生物工程，2007，(5):38 -41．

［6］ 徐佳杰，刘朋波，宫衡，等．1，3-丙二醇发酵过程中盐浓度的胁迫作用［J］． 生物工程学报，2008，24(6):1098 -11021．

［7］ 张浩勤，张伟，刘金盾，等．气相色谱法测定牛粪厌氧发醇液中挥发性脂肪酸［J］．郑州大学学报:工学版，2007(2):51 -53．

［8］ 中国环境保护部． HJ 535—2009，水质 氨氮的测定纳氏试剂分光光度法［S］．北京:中国环境科学出版社，2009．

［9］ 张延平． 1，3-丙二醇生物合成过程中的辅因子代谢调控［D］．北京:清华大学化工学院，2006．