刘春叶，王　拓，程传栩，聂太雷

(西安医学院药学院,陕西 西安710021)

赤芍是毛茛科植物芍药(PaeonialactifloraPall.)或川赤芍(PaeoniaveitchiiLynch)的干燥根，呈圆柱形，稍弯曲，气微香，味微苦、酸涩[1]，具有清热凉血、散瘀止痛的功效。

微波萃取是利用微波快速加热的特性，并结合传统溶剂提取法而发展的一种针对固体样品的新萃取技术。与传统中草药提取方法相比，微波萃取具有浸提时间短、效率高、加热均匀、安全环保等特点[2-5]。

响应曲面法(RSM)是数学方法和统计方法结合的产物，可用来对响应值受多个变量影响的问题进行建模和分析，其最终目的是优化该响应值[6]。采用响应曲面法可以建立连续变量曲面模型，对影响生物过程的因子及其交互作用进行评价，确定最佳水平范围。

目前，关于微波辅助提取赤芍活性成分的研究尚未见文献报道。作者拟建立赤芍活性成分的微波辅助提取法，并采用单因素实验与响应曲面法对提取条件进行优化，为更好地对赤芍活性成分进行提取、评价其药用价值提供帮助。

1　实验

1.1　材料与仪器

赤芍药材(产地安徽、甘肃、陕西)，购自西安市万寿路中药材市场，经西安医学院生药教研室张寒老师鉴定符合药典质量标准。将赤芍在40 ℃下烘干，粉碎，过40目筛，得赤芍粉。

FW-200型万能粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司；Beckman P/ACE MDQ型毛细管电泳仪，中国贝克曼库尔特商贸有限公司北京分公司；标准40目检验筛，上虞大亨桥化验仪器厂；CMD-20X型恒温鼓风干燥箱，上海琅玕实验设备有限公司；XH-300A型电脑微波超声波组合合成/萃取仪，北京祥鹄科技发展有限公司；RE-200A型旋转蒸发器，巩义市予华仪器有限责任公司；Anke TDL-40B型离心机，上海安亭科学仪器厂；UV-2102PCS型紫外可见分光光度计，尤尼柯仪器有限公司。

1.2　提取方法

为了保证实验效果和药材的合理利用，经过预实验计算，每次实验所用赤芍粉为1.0 g。

称取1.0 g赤芍粉置于250 mL圆底三颈烧瓶中，加入溶剂，在一定的微波功率、提取温度、提取时间、液料比下进行微波辅助提取，补重，浓缩提取液，定容，在200～400 nm范围内进行紫外扫描，以最大吸收波长处的吸光度作为评价指标进行提取效果对比。

1.3　毛细管电泳条件

采用75μm内径熔融石英毛细管柱(总长65 cm，有效长度60 cm)；分离电压20 kV；压力进样：0.5 psi×5 s，正极端进样，阴极端检测；分离温度25 ℃；检测波长260 nm；由Beckman P/ACE工作软件进行数据处理。

2　结果与讨论

2.1　单因素实验结果

2.1.1提取温度对提取效果的影响

固定液料比40∶1(mL∶g，下同)、提取时间20 min、微波功率1 000 W，考察提取温度(20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃)对提取效果的影响，结果见图1。

图1　提取温度对提取效果的影响

由图1可以看出，随着提取温度的升高，提取量先升高后降低，在80 ℃达到最高。这可能是因为，在一定的范围内，随着提取温度的升高，提取物在溶剂中的溶解度增大，提取量相应升高；但当提取温度过高时，溶剂部分挥发导致提取量降低；另一方面，当提取温度过高时，赤芍活性成分发生部分水解，由水溶性变成脂溶性，导致其在水中的溶解度变小，吸光度减小，提取量降低。

2.1.2液料比对提取效果的影响

固定提取温度80 ℃、提取时间20 min、微波功率1 000 W，考察液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1)对提取效果的影响，结果见图2。

由图2可以看出，在液料比为70∶1时，提取量达到最高。这可能是因为，当液料比较小时，溶出的活性成分较少；当液料比增大到一定值后，可以将赤芍活性成分充分溶出，此时提取液中的活性成分含量最多；当液料比继续增大，活性成分不再溶出，提取量不再升高。

图2　液料比对提取效果的影响

2.1.3提取时间对提取效果的影响

固定提取温度80 ℃、液料比70∶1、微波功率1 000 W，考察提取时间(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min)对提取效果的影响，结果见图3。

图3　提取时间对提取效果的影响

由图3可以看出，在提取时间为70 min时，提取量达到最高。这可能是因为，提取时间越长，赤芍活性成分在水中溶解量越多；提取一定时间后，赤芍活性成分向溶剂中的扩散速率与药物残渣对活性成分的吸附速率相等，提取液达到最大浓度，此时吸光度达到最大值，提取量达到最高。

2.2　响应曲面法实验结果

2.2.1Box-Behnken设计

在单因素实验的基础上，通过响应曲面法进行微波辅助提取赤芍活性成分的条件优化。Box-Behnken设计因素水平见表1，响应曲面法实验结果见表2，回归分析见表3。

表1　Box-Behnken 设计因素水平表

表2　响应曲面法实验结果

由表2得到相应的二次模型方程：Y=0.26+0.022A-0.001266B+0.008747C+0.014AB+0.007683AC+0.0001690BC+0.007036A2-0.013B2-0.009223C2。

由表3可知，二次模型的P值为0.03575，表明该模型显著；因素A的P值为0.0343，表明提取温度对提取效果影响显著。

根据响应曲面得出的等高线和曲面图分析各个因素之间的相互交叉影响。等高线的投影越接近椭圆，三维曲面图越陡峭、最高点越突出，说明该因素对应变量的影响越显著，其P值越小，方程中的绝对值越大。P值小于0.05的可以认为是有交互作用，曲面颜色的深浅则表示该区域实验组合的优劣[7]。

提取温度、提取时间、液料比之间的交互作用见图4。

表3　回归分析结果

由图4a可看出，当液料比(C)为70∶1时，等高线椭圆效果不好，提取温度和提取时间的交互作用不明显，与表3结果一致(AB两者的P值为0.2865>0.05，无交互作用)。

由图4b可看出，当提取时间(B)为70 min时，等高线椭圆效果不好，两者交互作用不明显，与表3结果一致(AC两者的P值为0.5385>0.05，无交互作用)。

由图4c可看出，当提取温度(A)为80 ℃时，等高线接近于圆，交互作用不明显，与表3结果一致(BC两者的P值为0.9890>0.05，无交互作用)。

采用Design Expert 8.0.6软件进行数据处理，确定赤芍活性成分的最优提取条件为：提取温度89.99 ℃、提取时间75.32 min、液料比79.25∶1(mL∶g)，此时，赤芍水提液的吸光度预测值为0.3022，实测值为0.2899。表明该模型预测效果良好。

2.3　毛细管电泳分离检测

在最优条件下微波辅助提取赤芍活性成分，采用毛细管电泳法进行分离检测，结果见图5。

由图5可见，赤芍水提液中所含组分相对较少。

2.4　不同产地赤芍活性成分的差异分析

在最优提取条件下，分别对安徽、甘肃、陕西3个产地的赤芍活性成分进行含量分析。将各水提液在200～400 nm进行紫外扫描，根据最大吸收波长处的吸光度大小判断不同产地赤芍活性成分的含量差异，结果见图6。

图4　提取温度、提取时间、液料比之间的交互作用

图5　赤芍水提液的毛细管电泳图谱

由图6可看出，陕西产赤芍水提液活性成分的含量稍大于甘肃和安徽，安徽和甘肃产赤芍水提液的活性成分含量接近。表明不同产地赤芍的活性成分含量存在一定的差异。

3　结论

以水为溶剂，采用微波辅助提取法对赤芍活性成分进行提取。通过单因素实验、Box-Behnken 设计和响应曲面法，借助Design Expert 8.0.6 软件，对赤芍活性成分的提取工艺进行了优化，确定最优提取条件为：提取温度89.99 ℃、提取时间75.32 min、液料比79.25∶1(mL∶g)，此时，赤芍水提液的吸光度预测值为0.3022，实测值为0.2899。该方法预测效果良好，可为中药活性成分的微波辅助提取提供参考。

图6　不同产地赤芍水提液的紫外吸收光谱

参考文献：

[1]冀兰鑫,黄浩,李长志,等.赤芍药理作用的研究进展[J].药物评价研究,2010,33(3):233-236.

[2]李健.微波萃取技术在中药方面的应用[J].贵阳中医学院学报,2002,24(4):38-39.

[3]冯年平，郁威.中草药提取分离技术原理与应用[M].北京:中国医药科技出版社,2005:340-350.

[4]王莉,鲁建江,顾承志,等.微波技术在板蓝根多糖提取及含量测定中的应用[J].中药材,2001,24(3):180-181.

[5]章凯,黄国林,黄小兰,等.响应面法优化微波辅助萃取柠檬皮中果胶的研究[J].精细化工,2010,27(1):52-56.

[6]安晓婷,王兴娜,周涛,等.响应曲面法优化蓝莓渣多酚提取工艺[J].食品工业科技,2012,(15):269-273.

[7]王安良,云霞,杨红.响应曲面法优化山药中多糖的微波提取工艺[J].食品科技,2007,32(12):86-90.