田 迎，王建东，滕兆刚，卢光明，郑 玲

293T细胞对介孔二氧化硅纳米材料的摄取研究

田 迎，王建东，滕兆刚，卢光明，郑 玲

目的：研究在脂质体Lipofectamine 2000的介导下，293T细胞对介孔二氧化硅纳米材料（mesoporous silica nanomaterials，MSNs）的摄取变化。方法：制备和表征MSNs；293T细胞分别与100 μg/mL MSNs、MSNs+Lipofectamine 2000共孵育，通过透射电镜（transmission electron microscope，TEM）观察及定量分析293T细胞对材料的摄取。结果：TEM、X线衍射及氮气吸附-脱附分析表明，制备的MSNs结构规则、分散性好，尺寸在100 nm左右；TEM定量结果发现，Lipofectamine 2000显著提高了293T细胞对MSNs的摄取，P＜0.001。结论：Lipofectamine 2000能提高293T细胞对MSNs的摄取，为MSNs在293T细胞内的生物应用创造了条件。

介孔二氧化硅纳米材料；Lipofectamine 2000；细胞摄取

0 引言

介孔二氧化硅纳米材料（mesoporous silica nanoparticles，MSNs）具有载药、靶向成像、诊疗等潜在的应用价值，成为生物医药领域新的研究热点[1-3]。细胞摄取对MSNs生物功能的发挥有重要的影响，MSNs表面的电荷修饰也反过来促进细胞对材料的吞噬[4]。阳离子脂质体Lipofectamine 2000是用于DNA、RNA转染真核细胞的生物学常规试剂，其作用原理是带正电的阳离子脂质体结合带负电的核酸物质，形成核酸-阳离子脂质体复合物，进一步吸附到带负电的细胞膜表面，通过内吞作用导入细胞[5]。目前，利用Lipofectamine 2000这一性质，包被或中和MSNs表面的负性电荷来提高MSNs细胞摄取率的研究还鲜有报道。本文针对此研究目的，初步探索在Lipofectamine 2000介导下人胚肾细胞系293T对MSNs摄取的影响。

1 主要材料与方法

1.1 MSNs的制备和表征

MSNs由实验室自制，制备方法参照文献[6]。MSNs利用透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）进行表征，加速电压为200 kV。首先配制0.05 g/L纳米粒的乙醇溶液，超声分散均匀后，滴于覆盖有膜的铜网上，真空干燥后，于Hitachi H-8100型透射电子显微镜下拍摄，观察纳米粒的尺寸及分散性。

1.2 细胞培养

人胚肾细胞系293T购自ATCC（Americantypecul ture collection）细胞库，在含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基（GIBCO）中培养，在37℃、5%CO2培养箱中孵育，每48 h传代1次。

1.3 MSNs与293T共孵育

将0.5 mg MSNs溶解在0.5 mL无血清培养基Op-ti-MEM I（Invitrogen）中，使终浓度（质量浓度）为100 μg/mL。将20 μL Lipofectamine 2000（Invitrogen）溶解在0.5 mL Op-ti-MEM I中，轻轻混匀。5 min

后，MSNs和Lipo-fectamine 2000充分混匀，室温孵育20 min。将混合物加入到汇合度70%、60 mm培养皿培养的293T细胞中，在37℃下孵育24 h，无Lipofectamine 2000介导的MSNs与293T孵育作为对照。

1.4 透射电镜观察293T细胞对MSNs的摄取

待293T细胞汇合度达70%后，加入混合均匀的MSNs，使其终浓度为100 μg/mL，于37℃下孵育24 h，清洗消化，收集细胞，用2.5%戊二醛固定、1%锇酸后固定1 h，丙酮脱水，Epon-812树脂包埋，45～65℃聚合48 h，半薄切片定位，70 nm超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双重电子染色，JEM-1011型透射电镜观察细胞对材料的吞噬结果。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行数据处理，定量结果以均数±标准差来表示。2组均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MSNs的合成和表征

MSNs制备后装入小型化学玻璃容器中，静置一段时间后观察纳米颗粒成乳白色且均匀地分散在溶液中，如图1（a）所示。TEM显示MSNs呈规则球状，尺寸在100 nm左右，颗粒之间无连接，如图1（b）所示。MSNs的X线衍射图上有3个衍射峰（100、110、200），表明此颗粒具有高度有序、规则的二维六方结构，如图1（c）所示。氮气吸附-脱附等温曲线显示在相对压力0.1～0.3处出现了快速的毛细凝聚，说明MSNs具有均一的介孔结构。计算得到MSNs的比表面积和孔容分别为834 m2/g和0.49 cm3/g。窄的孔径分布曲线进一步证明MSNs具有均一的介孔孔径，经过吸附分支计算得到的孔径尺寸为2.3 nm，如图1（d）所示。

2.2 293T细胞对MSNs的摄取

TEM进一步观察在Lipofectamine 2000介导下人胚肾细胞系293T对MSNs摄取的影响，无脂质体介导下的细胞摄取作为对照，MSNs终浓度为100 μg/mL，如图2所示。293T细胞非特异性吞噬MSNs，首先形成内涵体，之后进入细胞质形成二级溶酶体。通过定量包被MSNs的二级溶酶体后发现，与对照组293T细胞的平均摄取率为18%对比，在Lipofectamine 2000介导下，293T细胞对MSNs的平均摄取率为85%，P＜0.001，摄取率显著提高，如图3所示。

3 讨论

（a）MSNs分散性

（b）TEM分析

图1 MSNs性质分析

图2 TEM观察在Lipofectamine 2000介导下293T细胞对MSNs的摄取

图3 TEM观察下定量分析293T细胞对MSNs的摄取变化

在生物医药领域，MSNs以其规则的孔径结构、

可调的尺寸电荷、较大的表面积及可载药的孔径结构等优点，成为应用于多模态成像、靶向治疗研究的新型多功能材料[7]。增加细胞对纳米材料的摄取可以提高MSNs潜在的生物医药功能，扩大其应用范围，为临床疾病的特异性成像和靶向治疗提供基础[8]。细胞膜携带负电荷，使得同样表面带负电荷的MSNs的细胞吞噬率降低。脂质体是一种具有亲水头部和疏水尾部的双层脂分子的人工膜，利用其能和细胞膜融合的特点，可将药物或基因送入细胞内部，是应用较多的生物学常规试剂。Zhang Z等[9]发现阳离子脂质体Lipofectamine 2000能够促使超顺磁性氧化铁颗粒（superparamagnetic iron oxide，SPIO）进入细胞，且脂质体本身的细胞毒性很小。因此，本实验利用Lipofectamine 2000的特性，将纳米材料包裹在其阳性电荷表面并与细胞膜融合，研究在 Lipofectamine 2000介导下人胚肾细胞系293T非特异性摄取MSNs的变化。

本文制备的MSNs具有均一、有序的球状结构，其表面携带负电荷，未交联特异性配体，分散性较好。TEM结果显示，MSNs进入细胞后仍有良好的分散性，状态良好。定量包被MSNs的二级溶酶体发现，在阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导下，细胞摄取率明显高于对照组，P＜0.001。阳离子脂质体Lipofectamine 2000能有效提高 MSNs的细胞摄取率，是一种安全有效的脂类材料。继续深入利用和开发脂质体的细胞相容性作用，提高纳米材料在细胞中的摄取和生物功能的研究，实现生物材料与化学材料的有机结合，对推动纳米材料向生物、医学领域的转化应用具有重要的价值。

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（收稿：2013-07-31 修回：2013-12-10）

Experimental Study of Mesoporous Silica Nanomaterials Uptake in 293T Cell

TIAN Ying1,WANG Jian-dong2,TENG Zhao-gang1,LU Guang-ming1,ZHENG Ling1
(1.Department of Medical Imaging,Nanjing General Hospital of Nanjing Military Area Command,Nanjing 210002,China;、2.Department of Pathology,Nanjing General Hospital of Nanjing Military Area Command,Nanjing 210002,China)

Objective To study Lipofectamine 2000-guided uptake ofmesoporous silica nanomaterials(MSNs)in 293T cells.Methods MSNswere synthesized and characterized;293T cellswere incubated with MSNsorMSNsand Lipofectamine 2000 re-spectively,which both had a concentration of100μg/mL.Transmission electronmicroscope(TEM)wasused to analyze the up-take of MSNs in 293T cells.Results The analyses by TEM,X-ray diffraction and Nitrogen absorption-desorption showed theprepared MSNs behaved well in structure and dispersion and had a size of100 nm.TEM quantitative analysis found that Lipo-fectamine 2000 significantly enhanced the uptake ofMSNs in 293T cells,with P 0.01.Conclusion MSNs uptake promoted byLipofectamine 2000 lays a foundation for its biological application in 293T cells.[Chinese Medical Equipment Journal，2014，35（3）：26-28]

Mesoporous silica nanomaterials;Lipofectamine 2000;cellular uptake

R318

A

1003-8868（2014）03-0026-03

10.7687/J.ISSN1003-8868.2014.03.026

田 迎（1983—），女，硕士，技师，主要从事分子影像与分子病理学方面的研究工作，E-mail：ty52111@sina.com。

210002南京，南京军区南京总医院医学影像科（田 迎，滕兆刚，卢光明，郑 玲），医学病理科（王建东）

郑 玲，E-mail：cjr.zhengling@vip.163.com