张艳欧，虞 游，赵文铖，朱 涵，卢佳伟，姚卉卉，陈建明

（杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州310036）

喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势．目前，对喉癌等恶性肿瘤的传统治疗方法是手术、放疗和化疗，但对中晚期患者来说，传统疗法的疗效并不理想且有很大毒副作用．因此，近年来兴起的综合疗法倍受人们关注，干扰素（interferon，IFN）治疗肿瘤就是综合疗法中最重要的一种［1－2］．IFN是一种具有广泛生物活性的细胞因子，具有抗病毒、免疫调节、抗细胞增殖以及诱导细胞分化等功能．我们的前期研究发现，IFN－γ能抑制喉癌细胞Hep－2的增殖并诱导IFI16基因的表达，但却不影响与IFI16基因同一家族的MNDA基因的表达．我们推测IFN－γ抑制Hep－2细胞的增殖可能是通过诱导IFI16基因表达来介导的［3］．IFI16基因是干扰素可诱导表达的IFI－200（又称p200）家族成员之一，该家族在人体中有4个成员，分别是IFI16、MNDA、AIM2和IFIX［4－6］．近年来，有研究表明IFI16基因在头颈部肿瘤中起肿瘤抑制作用［7－9］．根据我们的前期研究结果表明：IFI16基因外来表达能抑制Hep－2细胞增殖、阻滞Hep－2细胞周期在亚G0期并诱导其发生凋亡，证明IFI16基因在Hep－2细胞中起增殖抑制作用．本文根据文献报道的IFI16基因siNRA序列，设计合成IFI16基因shRNA序列，连接到带有绿色荧光蛋白的表达载体pGreenPuroTMshRNA后，构建成IFI16基因shRNA的表达载体，该载体将为进一步深入研究IFI16基因在Hep－2细胞中的作用奠定基础．

1 材料和方法

1．1 主要仪器

MyGene PCR仪（杭州朗基公司），Tanon Gis System凝胶成像系统（上海天能科技）．

1．2 主要试剂

PCR扩增试剂盒（上海生工），DNA片段纯化／回收试剂盒（碧云天），DNA分子量标准、BamHI、EcoRI及T4DNA连接酶（碧云天），X－gal及IPTG（碧云天）．

1．3 质粒、菌种

大肠杆菌DH5α为本室保存，pGreenPuroTM克隆表达载体由浙江大学医学院提供．

1．4 IFI16基因shRNA的设计合成

文献［10］报道的IFI16基因siRNA序列（5'－CGCUGGUCCUAACCAAACGU－3'）设计合成为IFI16基因shRNA序列，正义链：5'－GAT CCG CTG GTC CTA ACC AAA CGT TTC AAG AGA ACG TTT GGT TAG GAC CAG CTT TTT G－3'；反义链：5'－AAT TCA AAA AGC TGG TCC TAA CCA AAC GTT CTC TTG AAA CGT TTG GTT AGG ACC AGC G－3'．根据pGreenPuroTMshRNA表达载体的要求，首先在IFI16基因siRNA序列的5'－端加上BamHI酶切位点，随后在其3'－端加上Loop环序列TTCAAGAGA，接下来再加上其反向互补序列ACGTTTGGTTAGGACCAGC，最后加上转录终止子序列TTTTT及EcroI酶切位点，此为IFI16基因shRNA的正义链序列．再按同样方法设计IFI16基因shRNA的反义链序列，将设计好的IFI16基因shRNA的正义链及反义链交由上海生工合成．

1．5 IFI16基因shRNA表达载体pGreenPuro－IFI16shRNA的构建

将合成好的IFI16基因shRNA的正义链和反义链退火成双链DNA．pGreenPuroTMshRNA载体经BamHI和EcoRI双酶切后，凝胶电泳纯化回收目的酶切产物．按照pGreenPuroTMshRNA表达载体构建要求，将双链IFI16基因shRNA和pGreenPuroTMshRNA载体酶切产物在T4连接酶的作用下连接，将连接产物转化到DH5α感受态大肠干菌中并涂到含有氨苄的筛选培养板上．挑取几个抗性单菌落，摇菌并提取质粒进行下一步鉴定．

1．6 pGreenPuro－IFI16shRNA表达载体的鉴定

以P－F和P－R为引物，对质粒进行PCR初步检测．PCR反应体系（20μL）：2×PCR Master 10μL；PF（10μM）0．5μL；P－R（10μM）0．5μL；质粒模板0．2μL；加灭菌水至20μL．载体鉴定引物P－F：5'－AAT GTC TTT GGA TTT GGG AAT CTT AT－3'；P－R：5'－TGG TCT AAC CAG AGA GAC CCA GTA－3'．反应条件94℃4min，94℃30s，58℃30s，72℃30s，循环25次，72℃延伸10min，4℃保存．1．5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统成像拍照．连入正确目的片段的质粒其PCR产物应为159bp，未连入目的片段的空载体可产生105bp的PCR产物．将PCR鉴定正确的质粒交由上海生工测序．

2 结 果

2．1 pGreenPuro－IFI16shRNA载体构建策略

设计合成好的IFI16基因shRNA，与经BamHI和EcoRI酶切后的pGreenPuroTMshRNA载体，用T4连接酶按常规方法进行连接，构建pGreenPuro－IFI16shRNA表达载体，构建策略见图1．

2．2 pGreenPuro－IFI16shRNA重组子PCR筛选

按上述构建策略将IFI16shRNA片段与pGreenPuroTMshRNA载体连接后的连接产物，转化DH5α菌后培养过夜，挑取几个抗性菌落用PCR法进行筛选．IFI16基因shRNA片段插入的重组子PCR扩增产物为159bp，而空载体PCR扩增产物为105bp，PCR筛选结果显示泳道2中的质粒DNA可能为目的重组子，PCR筛选结果见图2．

2．3 pGreenPuro－IFI16shRNA重组子测序鉴定

经PCR筛选可能为重组子的质粒DNA，选取一个送上海生工生物工程有限公司进行测序鉴定，测序结果显示重组子中插入片段的DNA序列与设计的IFI16shRNA序列完全一致，测序结果图谱见图3，测序结果说明成功构建了IFI16基因shRNA表达载体pGreenPuro－IFI16shRNA．

图1 pGreenPuro－IFI16shRNA载体构建策略图Fig．1 pGreenPuro IFI16shRNA Vector construction strategy schematic diagram

图2 pGreenPuro IFI16shRNA载体鉴定PCR结果Fig．2 The PCR identification result of pGreenPuro IFI16shRNA vetor

图3 pGreenPuro IFI16shRNA载体鉴定测序结果Fig．3 The sequencing result of pGreenPuro IFI16shRNA vector

3 讨 论

喉癌等恶性肿瘤的传统治疗方法主要有手术、放疗和化疗3种，传统疗法的疗效并不理想且毒副作用大．因此，近年来兴起的综合疗法倍受关注，以干扰素治疗肿瘤就是其中最重要的一种方法．IFI16是干扰素可诱导的IFI－200蛋白家族的一员，IFI16基因位于人一号染色体1q21－23区域，研究发现人一号染色体1q21－23区域的遗传改变与某些肿瘤及自身免疫疾病有关，目前已知IFI16基因是系统性红斑狼疮的易感基因［9－10］．此外，近年来的研究报道证实，IFI16基因在头颈部肿瘤中起抗肿瘤作用［7－9］．

我们前期研究发现，IFI16基因在Hep－2细胞内处于低表达状态，IFN－γ处理后能诱导其表达升高并能抑制Hep－2细胞增殖，由此推测IFI16基因可能介导IFN－γ对Hep－2细胞增殖的免疫抑制作用［3］；随后我们构建了IFI16基因的表达载体并发现IFI16基因外来过表达能抑制Hep－2细胞的增殖，IFI16基因外来表达抑制Hep－2细胞增殖的研究结果初步印证了推测［11－12］．为了进一步探讨IFI16基因是否介导IFN－γ免疫抑制Hep－2细胞的增殖，本文构建了IFI16基因shRNA的表达载体pGreenPuro－IFI16 shRNA，该载体在细胞内能转录表达出IFI16基因的小干扰性RNA，能特异性靶向沉默细胞内源性IFI16基因．利用本文构建的载体，我们可以在后续研究中通过转染筛选，建立细胞内源性IFI16基因靶向沉默的Hep－2细胞系，在内源性IFI16基因靶向沉默状态下研究IFN－γ处理对Hep－2细胞增殖及凋亡等的影响，可见，本文的研究结果将为进一步研究IFI16基因在IFN－γ免疫抑制Hep－2细胞增殖中的作用奠定基础．

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