赵迎晨　孔小平　朱　茜　袁晓丽

(河南省计量科学研究院，郑州 450008)

0　引言

液相色谱-质谱联用仪(以下简称仪器)因其准确的定性和定量能力，在食品、环境、生命科学等领域的应用越来越广。国家标准中利用液相色谱-质谱联用仪的分析方法逐年增多，从而使该仪器成为许多实验室的常规检测设备。液相色谱-质谱联用仪原理复杂，技术先进，多为进口厂家，软件操作复杂，对计量校准人员的知识水平要求较高。JJF 1317—2011仅对液相色谱-质谱联用仪的校准做出了指导性的说明，本文将结合仪器基本原理，介绍校准前的准备工作、注意事项，校准过程中遇到的技术问题及解决方法。

1　测量原理

液相色谱-质谱联用仪是将液相色谱仪与质谱仪联用的仪器，用于样品定性定量分析。样品通过液相色谱分离后的各个组分依次进入质量检测器，各组分在离子源被电离，产生带有一定电荷、质量数不同的离子。不同离子在电磁场中的运动行为不同，采用质量分析器按不同质荷比(m/z)把离子分开，得到依质荷比顺序排列的质谱图。通过对质谱图的分析处理，可以得到样品的定性和定量结果。图1为液相色谱-质谱联用仪的基本组成。

图1　液相色谱-质谱联用仪基本组成

液相色谱-质谱联用仪主要包括液相色谱系统、离子源、质量分析器、检测器、真空系统、数据处理和化学工作站等部分。离子源主要有大气压电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)等；质量分析器分为单四极杆(Q)、三重四级杆(QQQ)、离子阱(IT)和飞行时间质量(TOF)分析器等几种。

2　校准前准备工作

2.1　真空度

对液相色谱-质谱联用仪的校准，需要提前抽真空，真空度达到仪器使用要求后方可进行校准。由于质谱仪检测的是气相离子，离子要在电场、磁场或者电磁场中飞行一定的时间和空间才能到达检测器，如果这些时间和空间中存在大量的气体分子，分析的离子就会与气体分子发生碰撞而淬灭。所以，真空不仅是质谱正常运行的基本条件，也是保证仪器灵敏度重要因素之一。

2.2　质量校正

仪器长时间关机再使用，对质量轴、预四极杆进行过清洗或维护，环境温度变化较大，都有可能引起质量轴的偏移，此时需使用调谐液对质量进行校正。不同仪器厂家采用的调谐液不同，根据具体情况进行确定。常见种类有PPG(聚丙二醇)、碘化钠铯等溶液。

校准之前注意调用正确的调谐文件，笔者在工作中遇到Agilent6460质谱仪做质量准确性时，利血平的母离子质荷比(m/z)为606，检查后发现仪器自带的调谐液过期，自动调谐校准质量轴的时调谐(Tune)不通过，仪器错误的调用生成的失败调谐文件。换新的调谐液重新调谐后问题就解决了。

3　质谱参数的优化

开始校准之前，要优化目标化合物的质谱参数。一般采用浓度1μg/mL的利血平溶液标准物质，以流动注射的方式或者经液相色谱系统进样对质谱仪的参数进行优化。采用流动注射的方式优化时，最好是采用三通装置，流动相设置为校准的条件，使流动相和利血平溶液标准物质混合后一块进入质谱系统。在具体工作中发现，不同厂家的仪器具体操作时有很大的差别，下面以正离子模式的电喷雾电离(ESI+)模式为例，对校准工作中碰到的仪器进行说明。

3.1　WatersXevoTQ串联四极杆质谱仪

质谱部分带有自动优化功能，校准时将利血平溶液放到仪器指定位置，在Tune界面下选择液相和样品混合进样，参照仪器的操作说明，输入利血平的分子量608.3或者分子式C33H40N2O9，子离子个数先选择两个，因为利血平主要子离子就是195(m/z)和397(m/z)。然后点击开始自动调谐，就会生成保存仪器的选择反应监测(SRM)方法，调用方法时，选择生成子离子195(m/z)的质谱条件。

3.2　Agilent6400系列质谱仪

仪器一般都没有配置流动注射装置，优化质谱参数时需要采用液相系统，液相条件参照规范说明进行配置，为了节省时间，可以采用二通管代替色谱柱。首先进行母离子的扫描，选择单四级杆扫描(MSScan)模式确定母离子的m/z，碰撞诱导解离电压(Fragmentor)一般为100多伏。在选择反应监测(SRM)的模式下，输入母离子的m/z，优化Fragmentor，保证母离子的最大传输效率，一般从100V到200V间隔20V进行优化。最后在子离子扫描(production)模式下，输入母离子的m/z，最优Fragmentor值，设置不同的碰撞电压(CE)值，获得不同碎裂能量下的子离子，从而找到子离子195(m/z)最大响应时的CE值。一般在30±10电子伏特范围内进行优化。如果在最优的参数下，仪器的灵敏度仍不够，那就增大电子倍增器电压(EMV)到获得合适的响应。

3.3　Thermo TSQ质谱仪

在Tune Master窗口中点击On/Standby按钮，开启质谱仪。把利血平溶液装入到蠕动泵上的注射器上，通过peek管连到三通管和经液相出来的流动相混后进入质谱中。在选择离子扫描(Scan Type)模式中选择全离子扫描(Full Scan)模式进行母离子的优化，在此过程中可以选择显示轮廓图还是棒状图，选择轮廓图得到利血平母离子609(m/z)的半峰宽，进行分辨力的校准。对于利血平母离子从609(m/z)到195(m/z)的选择反应监测(SRM)，可以在Tune Master中的Control/Scan Mode工具栏上点击Compound Optimization Workspace，选择Optimization Modes：选择SRM按钮就可以自动完成优化。在进行一级质谱优化时，要留意参数优化是否成功。气压或真空度不够，会出现优化失败的情况，但仍可以继续优化。优化时，母离子必须达到规定的强度才能说明利血平离子是稳定存在的，这样才能保证各个参数优化的准确性。

3.4　AB SCIEX API系列

在软件导航栏的调谐(Tune)模式有两个作用：1)仪器全局参数的寻找，比如分辨率优化，质量数校准；2)分析方法的建立，比如母离子，子离子的寻找，选择SRM的参数优化等。实际校准工作当中，提前让仪器操作人员用PPG对仪器进行质量数相关参数的校准。对于校准工作，先用浓度大约0.1～1.0μg/mL的标样，通过注射泵(syringe pump)，采用流动注射分析(FIA)的方式，以5～10μL/min的流速，通过三通管和液相流动相混合后进入质谱，优化化合物(COMPOUND)项下面的参数，如去簇电压(DP)、聚焦电压(CE)、入口电压(EP)、碰撞室出口电压(CXP)及碰撞活化解离(CAD)等，在保证充分样品离子化基础上，DP低些使母离子丰度提高，总灵敏度相应也会提高。

4　校准过程及主要问题解决方法

4.1　分辨力和质量准确性

分辨力的校准要选择轮廓图，规范上说校准时直接注入或经液相系统注入5ng利血平。此处有些不妥，采用流动注射方式直接注入时，除了注入样品浓度外无法知晓注入质谱系统中利血平的质量。校准分辨力项目时规范建议采用100pg/μL的利血平标准浓度，注入5ng利血平需要50μL的进样量，对于液相系统这个进样量太大了。另外，由于超高效液相色谱(UPLC)和质谱联用技术的迅速发展，经液相系统注入5ng利血平就容易造成质谱检测器饱和，造成母离子609(m/z)质谱图出现平头峰。建议去掉注入5ng利血平的说明，改为根据实际情况采用100pg/μL或者10pg/μL的利血平标准浓度进行分辨力的校准。采用流动相进行稀释可以提高分离度，得到的峰形尖锐、对称。

质量准确性的校准可以与分辨力的校准过程结合进行。质谱采集时最好选择棒状图模式。在校准过程中，可以通过利血平母离子m/z与理论值609.28(m/z)的差别来判断仪器的质量轴是否校准好，以此来及时发现问题，并采取相应措施。

4.2　离子丰度比重复性

此项校准针对质量分析器为离子阱的质谱。离子阱质谱的主要优势是定性，定量能力较差。校准时首先选择适当的碰撞能量(CE)，使两个离子丰度比值在40%～150%之内，然后经色谱柱注入500pg利血平，经一级裂解记录397(m/z)和448(m/z)的丰度比。

4.3　信噪比、峰面积重复性与保留时间重复性

校准时，一般前几针进样重复性都不太理想，进样系统稳定后，取最后的连续6次作为测量结果进行计算。利血平的出峰时间一般都在5min以内，工作当中可能会碰到没有峰的情况，进几针以后如果还是没有峰出现，就要考虑是不是液相条件设置有问题，在校准工作中笔者发现有操作人员错误使用80%水的情况，导致利血平样品在色谱柱里洗脱不出来。

另外，JJF 1317—2011中，信噪比的测定条件只给出了进样量，在附录C中给出了校准用标准液浓度所对应校准项目，校准时按照附录C中建议方法进行。根据经验，进样体积超高效液相色谱(UPLC)2～5μL为最佳，高效液相色谱(HPLC)5～10μL为最佳，因为一般液体使用的色谱柱内径比较小，柱体积也小，进样体积太大会造成色谱柱饱和，影响分离效果。

目前仪器工作站一般有信噪比计算功能。基线噪声的定义有三种：峰/峰(peak to peak)信噪比、峰/半峰(half peak to peak)信噪比和均方根(RMS)信噪比。使用工作站信噪比功能时，要清楚仪器采用的噪声计算方式。根据JJF 1317—2011，应选择峰/峰信噪比，注意6次结果要选择相同时间段的噪声。峰面积重复性与保留时间重复性的测定，注意质谱条件中驻留时间(Dwell Time)的设置。驻留时间太长，色谱峰采样点太少，重现性下降，驻留时间太短，噪声会增高，信噪比降低。一般一个色谱峰，至少8点以上。另外，质谱软件一般都带有平滑功能，进行信噪比计算时，建议不要采用平滑功能，这样会平滑掉噪声，人为的增加仪器的信噪比。在考察峰面积重复性与保留时间重复性的时候，可以采用平滑功能。

5　结束语

仪器计量校准是一项细致而复杂的工作，特别是液相色谱-质谱联用仪的校准，影响因素多，涉及面广。掌握仪器的基本结构以及工作原理，提高自己的知识业务水平，才能在工作中遇到实际问题时，找到解决的方法，从而有效地保证计量校准工作的质量。

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