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(青岛大学医学院组织胚胎学教研室，山东 青岛 266021)

诱导型一氧化氮合酶(iNOS)正常生理情况下其活性不表达，而在病理情况下一些细胞因子可将其激活，如白介素-1、肿瘤坏死因子可以激活NF-κB、蛋白激酶等，进一步诱导iNOS 表达而引起NO合成增加[1]。研究结果显示，肿瘤的发生、发展和转移过程主要是通过上调iNOS活性、引起NO合成增加来实现的[2-4]。绿茶内含有茶多酚，其主要活性成分为表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。研究证实，绿茶及其提取物具有预防及抗癌的作用。然而，EGCG是否对人肺腺癌A549细胞有抑制作用，其抑制作用是否与iNOS表达有关系尚未见文献报道。因此，本实验主要研究EGCG对人肺腺癌细胞株A549细胞抑制作用及其与iNOS表达量的关系，为EGCG用于临床肺癌的治疗奠定实验基础。 现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

A549细胞由青岛大学医学院附属医院中心实验室提供，EGCG购自美国Sigma公司，一抗iNOS(兔抗人多克隆抗体)购自美国Abcam公司，二抗购自博奥森GS公司，RNA抽提试剂盒及RT-PCR试剂盒购自大连Takara公司；iNOS和GADPH内参引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 引物

根据NCBI基因序列及Primer 5.0软件设计iNOS、GAPDH 引物，引物序列见表1。

1.3 实验方法

1.3.1A549细胞培养及细胞增殖活性测定 将人肺腺癌A549细胞置于含有体积分数为0.01胎牛血清的DMEM-1640培养基中，置于37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中培养、扩增。取指数生长期细胞，计数并取相同细胞密度接种于96孔板。随机分为对照组和EGCG组，12 h后EGCG组分别加入不同浓度的EGCG，对照组加入等体积的无血清DMEM-1640培养液，每组设5个平行孔。24 h后用酶标免疫测定仪测定波长490 nm处吸光度(A)值，筛选EGCG最佳浓度，以用于下步实验。

表1 PCR的引物序列

1.3.2A549细胞凋亡检测 取对数生长期的细胞，调细胞密度为5×108/L，等量接种于6孔板,随机分为对照组(无血清DMEM-1640)与EGCG组(200 mg/L)，于37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中培养24 h。收集所有细胞，洗涤、重悬、计数并避光孵育30 min；Guava Easy Cyte Mini流式细胞仪检测10 000个细胞红色荧光和橙色荧光信号，实验结果采用流式四象限散点图表示，每个样品重复检测3次。

1.3.3A549细胞内iNOS蛋白的表达检测 ①免疫组化分析iNOS蛋白的表达：将密度为5×108/L的A549细胞等量接种于含有多聚赖氨酸包被的小玻片的6孔板中，随机分为对照组与EGCG组，细胞处理同上。培养24 h后用冷的40 g/L的多聚甲醛溶液室温固定10 min, PBS洗3次，每次3 min，具体步骤根据PV-9000二步法说明书操作。以细胞内呈现黄色或棕褐色颗粒为阳性反应，随机计数200个细胞，Image-pro Plus软件分析阳性信号强度。②蛋白质印迹定量分析iNOS蛋白的表达：同上密度的细胞接种于6孔板中，分组同上，24 h后收集A549细胞，加入RIPA蛋白裂解液，提取样品蛋白，BAC法定量蛋白含量；制备SDS-PAGE胶，常规电泳、转膜、封闭，一抗(iNOS 1∶2 000)4 ℃孵育过夜，二抗(1∶2 500)室温孵育2h，显色剂(1∶1)显色，Lane 1D凝胶分析软件分析，设未处理的细胞作为对照组，GAPDH作为内参照。

1.3.4A549细胞内iNOS mRNA表达检测 以Trizol法提取细胞总RNA，取1 μL反应体系，根据Takara逆转录试剂盒说明进行逆转录反应,并参照Takara Real Time-PCR说明书的步骤行PCR扩增,具体步骤如下：目的基因与内参均为95 ℃预变性30 s，然后95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，共35个循环。制定标准曲线，根据标准曲线公式计算样本的拷贝数。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 EGCG对A549细胞增殖活性的影响

MTT法的检测结果显示，50、100、200 mg/L的EGCG对A549细胞均有抑制作用，其增殖活性分别为0.165±0.031、0.145±0.003、0.121±0.001，对照组为0.585±0.002，其中200 mg/L的EGCG组细胞增殖活性与其他组相比较差异有显著意义(F=1 000.35，q=3.43～60.00,P<0.05)。200 mg/L的EGCG用于下一步实验。

2.2 EGCG对A549细胞凋亡的影响

EGCG组晚期A549细胞凋亡率与对照组比较，差异有显著性(χ2=65.23,P<0.05)。见图1。

图1 EGCG对A549细胞早晚期凋亡的影响

2.3 EGCG对A549细胞形态结构和iNOS蛋白表达的影响

免疫细胞化学观察结果显示，与阴性对照(图2A)相比，在无外界刺激时，A549细胞的胞质和细胞核内iNOS蛋白呈阳性表达(图2B)。EGCG孵育后可见许多A549细胞形态改变，核固缩，有的细胞染色质高度浓缩，呈聚集于核中央部的致密核，有的细胞染色质呈花瓣状或环状(图2C)；胞质浓缩、细胞体积变小，脱落、聚集。EGCG可以降低贴壁生长的A549细胞中iNOS蛋白的表达水平(图2C)，而固缩变小的A549细胞中iNOS蛋白表达增强，核碎裂时iNOS蛋白表达降低或呈阴性；对照组胞质与胞核iNOS蛋白的表达量分别为153.6±2.1、70.7±1.6，EGCG组胞质与胞核iNOS蛋白的表达量分别为90.6±1.0、60.7±1.9。与对照组比较，EGCG组A549细胞胞质与胞核iNOS蛋白的表达量明显降低，差异均有显著意义(t=8.7、18.2，P<0.05)。蛋白质印迹定量分析显示，对照组与EGCG组A549细胞iNOS蛋白的表达量分别为25.6±1.6、6.4±0.7，与对照组比较，EGCG组A549细胞中iNOS蛋白的表达量明显降低，差异有显著性(t=9.4,P<0.05)。见图3。

2.4 EGCG对A549细胞iNOS mRNA表达影响

正常组与EGCG组A549细胞iNOS mRNA相对表达量分别为0.565±0.002、0.232±0.003，与对照组比较，EGCG组iNOS的mRNA相对表达量明显下调，差异有显著性(t=5.7,P<0.05)。

图3 蛋白质印迹定量分析A549细胞中iNOS蛋白的表达量

3 讨 论

NOS是体内催化L-精氨酸生成NO的关键酶。目前已知的NOS分为4种类型：iNOS、神经型NOS(nNOS)、内皮型NOS(eNOS)，其中iNOS常在炎症反应、免疫反应及老化过程中被激活，激活后可在皮肤组织内产生高水平的NO。NO是一种活性气体小分子，可通过不同途径介导组织损伤、细胞凋亡等病理过程[5]。有研究结果显示，iNOS可导致心肌细胞损伤，其机制可能包括以下几个方面：NO反应生成超氧自由基，可诱导DNA损伤；NO可抑制线粒体呼吸，阻断细胞内能量合成及DNA的复制；NO能直接诱导细胞凋亡；NO作为氧自由基，调节p53基因，同时降低Bcl-2和上调Bax水平，促使Bcl-2/Bax比例失调，使之堆积并阻止细胞进入DNA合成期[6]。

茶多酚是从绿茶中提取出的多酚类化合物，儿茶素是茶多酚的主要成分。EGCG是茶多酚中含量最高，活性最强的单体[7-8]，具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用。本实验结果显示，在浓度为50～200 mg/L范围内，EGCG可明显抑制人肺腺癌细胞A549的增殖，其浓度在200 mg/L时抑制作用更强。流式细胞仪检测细胞结果显示，EGCG可使处于早期和晚期凋亡的A549细胞百分率增加，晚期凋亡率增加更明显，提示EGCG导致A549细胞不可逆性凋亡。免疫细胞化学法检测结果显示，A549细胞出现核固缩、胞质浓缩、细胞体积变小等凋亡细胞的形态学特征；同时蛋白质印迹定量分析和RealTime-PCR方法检测结果一致，EGCG可抑制iNOS蛋白与mRNA的相对表达量。由此推测，EGCG可能通过抑制A549细胞增殖，促进细胞凋亡，下调iNOS蛋白与mRNA的相对表达量发挥抑癌作用。

[参考文献]

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[8] 杨彤涛,牛子长,李存孝,等. 表没食子儿茶素-3-没食子酸酯抑制骨肉瘤细胞增殖及其机制[J]. 实用医学杂志, 2007,23(10):1449-1451.